Menneskelige telomerase revers transkriptase (TERT) syntetiserer ikke bare telomeric DNA, men også double-strandet RNA gjennom RNA-avhengig RNA polymerase aktivitet. Her beskriver vi en nyetablerte analysen for å oppdage RNA-avhengig RNA polymerase aktivitet av endogene TERT.
Menneskelige telomerase revers transkriptase (TERT) er det katalytisk delenhet i telomerase, og det elongates telomere gjennom RNA-avhengig DNA polymerase aktivitet. Selv om TERT er benevnt idet en revers transkriptase, viser strukturelle og Fylogenetiske analyser av TERT at TERT er medlem av høyrehendt polymerases, og forholder seg til viral RNA-avhengig RNA polymerases (RdRPs) og viral revers transkriptase. Vi først identifisert RdRP aktivitet av menneskelig TERT som genererer komplementære RNA står til en mal ikke-koding RNA og bidrar til RNA stanse i kreftcellene. For å analysere denne ikke-kanoniske enzymatisk aktivitet, vi utviklet RdRP analysen med rekombinant TERT i 2009, deretter etablert i vitro RdRP analysen for endogene TERT. I dette manuskriptet beskrive vi sistnevnte. TERT immun komplekser er kort, isolert fra celler, og inkubert med malen RNA og rNTPs inkludert radioaktivt rNTP for RdRP reaksjon. For å eliminere single-strandet RNA, behandles reaksjon produkter med RNase jeg, og de siste produktene analyseres polyakrylamid gel geleelektroforese. Radiolabeled RdRP produkter kan bli oppdaget av autoradiography etter overnatting eksponering.
Menneskelige telomerase revers transkriptase (TERT) er kjent som den katalytiske delenhet i telomerase, og det elongates telomere bruker telomerase RNA-komponenten (TERC), den spesifikke RNA mal1. Selv om TERT polymerizes telomeric DNA som en del av telomerase, indikerer de strukturelle og Fylogenetiske analysene at TERT er nært beslektet med viral RNA-avhengig RNA polymerases (RdRPs) samt viral revers transkriptase og deler domener med disse polymerases2,3,4. RdRP er enzymet som genererer komplementære RNA strand til en mal RNA. Enzymet er kodet ikke bare i virus, men også i modellen organismer, som plante, gjær og ormen, og double-strandet RNA syntese av RdRP bidrar til transcriptional og post-transcriptional genet stanse i disse organismer5,6 . Selv om menneskelig RdRP hadde vært savnet i lang tid, fant vi RdRP aktivitet i menneskelig TERT i 20097.
Vi først bekreftet RdRP aktivitet av TERT med rekombinante proteiner7, så etablert en følsom i vitro analysen for å oppdage RdRP aktivitet av endogene TERT8. Her viser vi i vitro RdRP analysen (IP-RdRP analysen) for endogene TERT. Denne metoden starter med immunoprecipitation (IP) av endogene TERT, og etterfølges av i vitro RdRP reaksjon, der radioaktivt ribonucleotides er innlemmet i begynnende RNA tråder.
IP-RdRP analysen er en følsom å oppdage RdRP aktivitet av menneskelig TERT. TERT protein er svært uttrykt i mitotisk HeLa celler, der TERT danner RdRP komplekse8,9,10. Dette tyder på at mitotisk HeLa celler er en optimal materiale å oppdage RdRP aktivitet. I protokollen beskrevet ovenfor, er mitotisk og ikke-synkroniserte HeLa celler inkludert som en positiv og en negativ eksempel, henholdsvis. Som vist i figur 1A, RdRP analysen produkter fra malen for anbefalte RNA i mitotisk HeLa celler Vis bred radioaktivt signaler mellom 20 til 30 nt. I tillegg til HeLa celler, vi har utført analysen med ulike typer linjer, og fant at signalet mønsteret kan endres i ulike celle typer9: noen viser et sterkt signal bare rundt 30 nt, noen viser et lignende mønster med HeLa celler. Vi har også utført analysen med RNA maler enn 34 nt mal8, kort og lang (~ 300 nt) RNAs med forskjellige sekvenser, og vellykket innhentet RdRP produkter fra malene selv om det kan være noen preferanse. For det første prøve, men anbefaler vi bruker HeLa celler i mitotisk fase og 34 nt RNA malen. RdRPs kan generere double-strandet RNA både en primer-avhengige og en primer-uavhengig måte11. Vi har rapportert at TERT beholder denne egenskapen for menneskelig RdRP7,9; TERT syntetiserer dsRNA fra en RNA mal med 3-foldback struktur gjennom en tilbake-grunning mekanisme7. For malen 34 nt RNA syntetiserer TERT komplementære tråder uten å bruke primere9. Spesielt oppdage RdRP produkter syntetisert i en primer-uavhengig måte, dvs de novo syntetisert RNA produkter, [α –32P] NTP kan erstattes med [γ –32P] NTP i RdRP reaksjon9.
MNase behandling av TERT immun komplekser på perler er et viktig skritt for å oppnå ønskede resultater. Hvis MNase behandling utføres lenge eller med intensiv risting, reduseres RdRP produktene bemerkelsesverdig. For å unngå slike problemer, anbefaler vi sterkt å strengt følge protokollen nøye. HMD løsning er en kritisk faktor for suksess. Hvis du finner at signalene er veldig svak, erstatte HMD løsningen på en nylig utarbeidet.
Hele protokollen, bør man ta stor forsiktighet for å unngå RNase forurensning. Ribonuclease behandling bør utføres med dedikert utstyr. Etter manipulerer Ribonuclease, en bør kaste tips og rør med RNase umiddelbart, eliminere RNase med spesialiserte løsning (f.eks RNase stille), og endre lunder.
TERT samhandler med ikke bare TERC men også mange typer endogene RNAs, og vi har rapportert en del av dem7. Endring i IP-RdRP analysen, som IP-RdRP analysen uten MNase behandling, vil gi en fullstendig liste over endogene RNA maler for TERT-assosiert RdRP aktivitet og bioinformatic guide på deres sekvens funksjoner. Vi har aktivert denne protokollen til vev lysate. Fordi TERT er uttrykt i en rekke normal og tumor vev, kan denne analysen være nyttig å undersøke ikke-kanoniske enzymatisk funksjon av TERT i menneskelig.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet var støttes delvis av prosjektet for utvikling av nyskapende forskning på Cancer Therapeutics (P-direkte) (15cm0106102h0002 km) og prosjektet for kreftforskning og terapeutiske utvikling (P-opprette) (16cm 01061150001, km) fra Japan Agency for medisinsk forskning og utvikling, AMED; Takeda Science Foundation (Y.M.); Tildeling av prinsesse Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M.); og JSP KAKENHI bevilgning nummer JP16K07133 (Y.M.).
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
Proteinase K | Takara | 9033 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |