Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture
Summary
Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) ex Vivo bietet eine wertvolle 3D-Modell des Virus Pathogenese. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu verarbeiten und infizieren Gewebeproben aus menschlichen Tonsillen und weiblichen genitalen Schleimhäute mit HIV-1 und in der Kultur an der Air liquide-Schnittstelle zu erhalten.
Abstract
Histocultures erlauben Untersuchung interzelluläre Wechselwirkungen im menschlichen Gewebe, und sie können Modell Wirt-Pathogen Interaktionen unter kontrollierten Laborbedingungen eingesetzt werden. Ex-Vivo -Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV), unter anderen Viren hat erfolgreich zur frühen Pathogenese der Krankheit, sondern als Plattform zum Testen der Wirksamkeit und Toxizität von antiviralen Medikamenten untersuchen. In diesem Protokoll erklären wir, wie zu verarbeiten und mit HIV-1 Gewebe Explantaten aus menschlichen Tonsillen und Gebärmutterhalskrebs Schleimhäute infizieren und pflegen sie in Kultur auf Gelatine Schwämmen an der Air liquide-Schnittstelle für etwa zwei Wochen. Dieser unpolarisierte Kultureinstellung maximiert Zugang zu Nährstoffen in Kulturmedium und Sauerstoff, obwohl fortschreitenden Verlust von Gewebe Integrität und funktionale Architekturen die wichtigste Einschränkung bleibt. Diese Methode ermöglicht die Überwachung von HIV-1-Replikation und Pathogenese mit mehreren Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR und Durchflusszytometrie. Von Bedeutung kann die physiologische Variabilität zwischen Gewebespender sowie Explantaten aus verschiedenen Bereichen der gleichen Probe, experimentelle Ergebnisse erheblich beeinträchtigen. Um Ergebnis Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Explantaten, technische repliziert und Spender abgestimmt Kontrolle Bedingungen verwenden, um die Ergebnisse der experimentellen Behandlungen zu normalisieren, wenn Sie Daten aus mehreren Experimenten zu kompilieren (dh ., durchgeführt mit Gewebe von verschiedenen Spendern) zur statistischen Auswertung.
Introduction
Außerdem Bi-dimensionale Zellkulturen, hier bezeichnet als herkömmliche, entfallen nicht die räumliche und funktionale Kommunikation zwischen der Vielzahl von Zelltypen, die Gewebe zu komponieren und Organe. Dieser Aspekt ist von größter Bedeutung für experimentelle Modelle der Krankheit, wie Interferenz mit den homöostatischen interzelluläre Wechselwirkungen der treibende Faktor für alle Krankheiten ist. Gewebe-Explantaten bieten entscheidende Vorteile für die Modellierung von Gesundheit und Krankheit beim Menschen, weil sie die Cytoarchitecture und viele wichtige funktionale Aspekte der Organe behalten, wie sie in Vivo, obwohl für eine begrenzte Zeit1. Beispielsweise auf ex Vivo mit Recall-Antigenen, wie Diphtherie-Toxoid oder Tetanus-Toxoid, reagiert rachenabstrichen Gewebe mit einer starken Produktion von Antigen-Antikörper-2. Wie jedes andere ex Vivo Modell, Histoculture hat seine eigenen Grenzen: Inter Spender Variabilität, Gewebe Polarisation, begrenzte Gewebe überleben und Schwierigkeiten bei der Überwachung der Zellen über die Tiefe der konfokalen Mikroskopie1. Menschliches Gewebe Explantaten dennoch ein Modell der Wahl homöostatische und pathogene immunologische Prozesse im Menschen, einschließlich der Wirt-Pathogen Interaktionen und mögliche therapeutische Interventionen3zu studieren.
Die kritischen Ereignisse der Pathogenese der HIV-1 statt in Geweben. Infektion der genitalen Schleimhaut Konten für die Mehrheit aller HIV-1-Übertragung Veranstaltungen weltweit4. Lymphgewebe ist der Hauptaufstellungsort der Replikation des Virus während der akuten Infektion birgt einen erheblichen Pool von latent infizierten Zellen5und ihre Beharrlichkeit ist das Haupthindernis für eine Heilung6zu erreichen. Die Kultur und ex-Vivo Herausforderung der menschlichen lymphatischen und Schleimhaut-Gewebe bieten einige Vorteile gegenüber herkömmlichen Systemen auf Basis von isolierten Zellen für die Untersuchung von HIV-1. Gewebe-Resident Zellen können beispielsweise HIV-1-Infektion ohne exogene Aktivierung, im Gegensatz zu peripheren mononukleären Zellen1unterstützen. Die Verwendung von Lymphgewebe Explantaten erlaubt ein besseres Verständnis für einige wichtigen Mechanismen, die CD4-T Zelle Entleerungd. h., die Bystander Effekt7, das ist das Markenzeichen der akuten Infektion hat. Die Erhaltung der Strukturen wie B-Zell-Follikel im Lymphgewebe8 und das Epithel in weiblichen genitalen Schleimhaut Explantaten9 bietet die einzigartige Möglichkeit, räumliche und funktionelle Eigenschaften von HIV-1-Infektion an diesen Standorten zu integrieren. Schließlich wurden Histocultures erfolgreich Modell und Studie HIV-1 und Herpes-Co-Infektion10,11, verwendet sowie für präklinische Tests von antiretroviralen Medikamenten und Multitarget Mikrobizide12, 13 , 14 , 15.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Kultur der menschlichen Gewebe Explantaten aus Mandeln und Schleimhaut aus den unteren weiblichen Genitaltrakt (Zervix), gewonnen mit Gewebe Dissektion um Herausforderung mit HIV-1 in einer Weise unpolarisierte explant. Die Kultur der Gewebe Explantaten an der Air liquide-Schnittstelle, mit Gelatine Schwämmen als Unterstützung, maximiert die Exposition um Sauerstoff der Luft und bietet Zugriff auf Nährmedium Nährstoffe durch den Schwamm Kapillaren, verzögert ihre natürlichen Verfall. Die unmittelbarste Weise HIV-1-Replikation in unserem System zu bewerten ist, Messen Sie die Menge des Virus in das Kulturmedium Explant im Laufe der Zeit von Immunoassay oder qPCR freigegeben. HIV-1-Infektion und Pathogenese (zB., CD4 T Zelle Entleerung) können auch im Gewebe Explantaten durch Masse RNA/DNA-Extraktion und qPCR, in Situ Beflecken oder einzelne Zellanalyse auf Gewebe Verdauung durch Durchflusszytometrie ausgewertet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Verwendung von menschlichem Gewebe explants für das Studium der HIV-1-Infektion Vorteile gegenüber den herkömmlichen zweidimensionalen und außerdem experimentellen Systemen wie Primärzellen oder Zell-Linien, durch ihre überlegene Fähigkeit zur Fortpflanzung interzelluläre Wechselwirkungen bietet und zelluläre Funktionen (z.B.Produktion von Zytokinen) sind in Vivo. Dennoch, Tonsillen und zervikalen Gewebe unterscheiden sich in vielerlei Hinsicht, einschließlich der Anzahl und phänotypische…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Stiftung Blanceflor Boncompagni Ludovisi geb. Bildt (http://blanceflor.se/), die Stiftung schwedische Ärzte gegen AIDS (http://www.aidsfond.se/, Ref. FOa2014-0006) und Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/), Andrea Introini.
Materials
| Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge | Pfizer | NDC: 0009-0315-08 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge | Ferrosan Medical Devices | MS0002 | Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue. |
| RPMI 1640 with phenol red and glutamine | ThermoFisher Scientific | 21875034 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Modified Eagle's medium (MEM) non-essential aminoacids (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Sodium pyruvate, 100 mM (100x) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Gentamicin 50 mg/mL (1000x) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Amphotericin B 250 μg/mL (100x) | ThermoFisher Scientific | 15290018 | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). |
| Fetal bovine serum (FBS) | To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM). | ||
| Ticarcillin disodium salt | Sigma-Aldrich | T5639-1G | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Potassium clavulanate | Sigma-Aldrich | 33454-100MG | Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT. |
| Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red | To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage. | ||
| Sterile cell culture grade water | |||
| Sterile transportation container | |||
| 70% ethanol solution | |||
| Disinfectant solution for biological waste disposal | |||
| Sterile metal forceps or tweezers | |||
| Sterile metal scissors | |||
| Sterile flat weighing metal spatula | |||
| Sterile scalpels and blades | |||
| 6-well cell culture plates | |||
| 12-well cell culture plates | |||
| Sterile Petri dish, 100 mm × 20 mm | |||
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL | NIH AIDS Reagent Program | 510 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04 | NIH AIDS Reagent Program | 2522 | The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Lamivudine (3TC) | NIH AIDS Reagent Program | 8146 | Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 °C. Avoid repeated freezing and thawing. |
| Biological safety cabinet | |||
| Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 °C, 5% CO2, ≥ 90% humidity | |||
| Water bath set at 37 °C | |||
| Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes | |||
| Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 °C, 300 rpm |
Referencias
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