Medição padronizada da diferença de potencial transepitelial de membrana Nasal (NPD)
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para medir a diferença de potencial nasal (NPD). Regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e de sódio epitelial (ENaC) de canal função são avaliados pela mudança na tensão entre o epitélio nasal após superfusion de soluções que modificam a atividade do canal de íon, fornecendo um medida de resultado.
Abstract
Nós descrevemos uma medição padronizada da diferença de potencial nasal (NPD). Nesta técnica, regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e a função de canal (ENaC) epiteliais de sódio são monitorados pela mudança na tensão entre o epitélio nasal após o superfusion de soluções que modificar o canal iônico atividade. Isto é permitido a medição da diferença de potencial entre o compartimento subcutâneo e o epitélio das vias aéreas na narina, utilizando um cateter em contacto com o corneto nasal inferior.
O teste permite a medição da tensão de linha de base estável e as alterações sucessivas tensão líquida após a perfusão de 100 µM amilorida, um inibidor de reabsorção de Na+ em solução de Ringer; uma solução de cloreto livre contendo amilorida a secreção de cloreto de unidade e 10 µM isoproterenol em uma solução de cloreto livre com amilorida para estimular o adenosina monofosfato cíclica (cAMP)-condutância cloreto dependentes relacionados a CFTR.
Esta técnica tem a vantagem de demonstrar as propriedades eletrofisiológicas de dois componentes-chave que institui a hidratação do líquido das vias respiratórias superfície do epitélio respiratório, ENaC e CFTR. Portanto, é uma ferramenta útil de pesquisa para a fase 2 e comprovante de ensaios conceito agentes CFTR e ENaC atividade para o tratamento da doença de pulmão fibrose cística (CF) de destino. É também um procedimento de acompanhamento chave para estabelecer a disfunção CFTR quando genética e teste de suor são equívocos. Ao contrário de cloreto de suor, o teste é relativamente mais demorado e caro. Ele também requer treinamento do operador e expertise para realizar o teste de forma eficaz. Variabilidade intere intra – subject relatou nesta técnica, especialmente em indivíduos jovens ou não cooperativos. Para ajudar com esta preocupação, interpretação foi melhorada através de um algoritmo recentemente validado.
Introduction
O objectivo geral deste método é medir a diferença de potencial nasal (NPD) que visa investigar o transporte trans-epitelial íon na vivo1. Esta técnica permite a medição de sódio (Na+) e transporte de cloreto (Cl.–). NPD tem sido utilizado como ferramenta de pesquisa desde a década de 1980 e foi aceito como um procedimento diagnóstico em 1998, pela Fundação de fibrose cística (CFF) consenso instrução2 e em 2017 nas diretrizes do diagnóstico da Fundação de fibrose cística (CFF) consenso 3. com efeito, disfunção biológica de CFTR, que é a causa da CF, é evidenciada por uma maior absorção de at+ na membrana apical e um defeito na secreção de Cl– . Este teste funcional oferece a vantagem de uma ferramenta de diagnóstico adicionais quando genética é não-conclusivo em pacientes com teste de suor intermédio indeterminado resultados3. Embora essas informações podem também ser obtidas por biópsias de medição atual intestinal (ICM), o ICM é, no entanto, somente disponível em alguns centros globalmente e precisa mais padronização. NPD é mais disponível em aproximadamente 60 centros globais e, além disso, metas do epitélio respiratório que é o principal local da doença.
Tendo em conta as informações que ele fornece na atividade CFTR, também é usado em estudos de prova de conceito, com o objetivo de avaliar a recuperação funcional da proteína CFTR pelo modulador terapias4,5,6,7, 8. De facto, dados de estudos com edição de mRNA/gene CFTR, potenciador de CFTR e terapias de corrector, realçar alterações significativas na Cl– e at+ transporte com terapia6,9 e confirma que o NPD pode ser um ponto de extremidade responsivo em ensaios clínicos. Como temos falta pontos finais clínicos sensíveis capazes de detectar uma sutil mudança no estado clínico do paciente, a curto prazo, este biomarcador pré-clínica pode ser altamente informativa. O campo das terapias de modulador CFTR amplia rapidamente e precisamos urgentemente de testes na vivo que são capazes de decifrar rapidamente compostos ativos antes de ir para a grande fase 3 ensaios10.
A lógica fisiológica da técnica baseia-se na medição da diferença potencial entre o epitélio das vias aéreas na narina e o compartimento subcutâneo. Atividades do canal de íon são exploradas, medindo a diferença de potencial máxima de linha de base estável (PD), suas alterações após bloquear a ENaC relacionadas a absorção at+ e secreção de Cl– de condução através de diferentes transportadores apicais de Cl– incluindo a CFTR. Disfunção CFTR é mostrada por uma mudança mínima na diferença de potencial sobre estimulação da secreção de Cl– com um acampamento caminho dependente e um aumento ENaC mediada por absorção at+ detectadas por uma diferença de potencial mais negativa da linha de base e uma resposta reforçada para amilorida. A base mecanicista para CF versus normal PD está resumida na Figura 1.
Figura 1: figura Resumo da actividade do canal iônico. Íon (A) atividade em demonstrar o epitélio respiratório equilibrado atividade de ENaC e CFTR em indivíduos normais e (B) perda de atividade CFTR, resultando em maior transporte de sódio ENaC mediada e reduzida dependente cloreto CFTR transporte. ENaC: canal de sódio epitelial, at+: sódio, CFTR: fibrose cística regulador transmembrana, CL–: cloreto, mV: milivolts, PD: diferença de potencial, min: minuto/s , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
No entanto, este teste demonstra algum grau de variabilidade tanto em medidas repetidas no mesmo paciente e entre os pacientes com o mesmo genótipo. Isto é de extrema importância para facilitar a interpretação das mudanças após o tratamento do modulador. Além disso, falta-nos ainda validados limiares discriminar entre CF e indivíduos saudáveis. Isto pode ser parcialmente devido às diferenças entre a disponibilidade de instalações clínicas e as técnicas empregadas. Portanto, um considerável esforço internacional destinado a padronização do teste está em andamento. Tanto nos CFF-TDN (rede de desenvolvimento de terapêutica-Fundação de fibrose cística) e o ECF-CTN (rede europeia de fibrose cística-sociedade clínica ensaios) criaram um procedimento operacional padrão do NPD (SOP) para o uso nos julgamentos multicêntrico e pesquisa. Este recente trabalho colaborativo pelo CTN e TDN resultou em um SOP combinada, internacional, reunindo os conhecimentos do CTN e TDN (2014)11. Este artigo apresenta as técnicas de protocolo e teste para empregar NPD para diagnóstico de CF ou para ensaios de prova de conceito iniciado pelo investigador. Cada centro de aplicação da técnica é responsável pela aplicação de sua Comissão de ética de pesquisa humana institucional para aprovação.
Figura 2: diagrama esquemático de todo recomendado configuração NPD. Observe que a configuração recomendada é mostrada, incluindo bombas de perfusão sequencial e a configuração de série 4-paragem-pau. Conexões específicas e exemplos de componentes são mostrados na SOP. (Diagrama modificado com permissão de Salomão, no peito, G.M. 201013) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O fluxo geral experimental é descrito na Figura 2, pelo qual o NPD é medido entre a ponte explorando posicionada sobre a ponte de superfície e referência de epitélio colocada no espaço subcutâneo, ambos conectados a eletrodos e uma alta impedância voltímetro.
Isso é assegurado por 2 sistemas diferentes: existem 2 configurações de eletrodo de referência aceitável: (i) equilibrado eletrodos de Ag/AgCl e uma ponte de creme do eletrocardiograma (ECG) ligado ao espaço subcutâneo por ligeira abrasão ou (ii) saturado de calomelano semicélulas e um ágar cheio de 22 a 24-agulha introduzida por via subcutânea. O contato com a mucosa nasal é ativado por um cateter de duplo lúmen. Um lúmen é preenchida com ágar-ágar ou creme de ECG e ligado ao eléctrodo de medição, a outra permite a perfusão na mucosa nasal das diferentes soluções.
A ponta do tubo de explorar é colocada na mucosa respiratória sob o inferior nasal corneto (Figura 3).
Figura 3: colocação de tubos no mucosa respiratória a explorar. (A) colocação de apresentando visão externa. (B) vista rinoscópico demonstrando a colocação. (C) diagrama indicando a localização anatômica para colocação do cateter. PD: diferença de potencial
Para estudar a resposta do PD para vários medicamentos, as soluções superfusion são aplicadas através do segundo lúmen do cateter. Existem várias etapas-chave sobre a preparação e realização das medições do NPD, que são detalhadas abaixo no protocolo, desde a preparação inicial através de análise de dados.
Após a preparação de soluções e eletrodos, testes de qualidade adequada dos eletrodos e cateteres permite o comportamento básico do teste. São realizadas medições basais ao longo do corneto, inferior que permite a seleção do melhor local para a medição, geralmente que a medição mais negativo. Então perfusions sequenciais determinam at+ (ENaC) e Cl– fluxo de iões (CFTR-dependente) através de uma mudança de tensão entre o epitélio nasal.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo, NPD fornece uma única medição que pode ser executada repetidamente em uma base longitudinal e demonstra que, com medidas repetidas, resultados longitudinais semelhantes são observados em uma base individual e armazenando14, 15. Há fortes evidências que o NPD tem validade excelente discriminação para distinguir CF do não-CF. 25 estudos consistentemente demonstraram uma diferença estatisticamente significativa na Cl– e condutância at+ entre pacientes com FC e controles saudáveis10. Enquanto vários índices previamente desenvolvidos demonstram essa capacidade, prevemos que novas atualizações são necessárias dada a recentes padronizações de metodologia7,8.
Modificações e solução de problemas
Este teste requer várias etapas-chave para assegurar medições precisas. Isso inclui o deslocamento de loop fechado de eletrodos e cateteres para garantir que o sistema está executando aos padrões recomendados. Os pacientes devem ainda permanecem e abster-se de falar como isso minimiza artefatos e desalojamento de cateter. Isto dificulta o teste em pacientes não-cooperativos e a técnica só tem sido relatada em um estudo em crianças abaixo de 6 anos de idade7.
Inspecção preliminar do epitélio nasal é necessária garantir que não existem crostas ou muco no epitélio, que pode afetar as medidas.
Muito importante, deve-se salientar que o local de colocação do cateter é objecto de debate. O SOP aqui apresentada utiliza medição sob corneto inferior (IT). A colocação do cateter sob o que foi padronizada e realizada em ensaios multicêntricos e, portanto, esta é a técnica recomendada. Medição sob o IT é executada com o cateter de lado-buraco, que pode ser difícil de manter em contato firme com a mucosa nasal, enquanto estar em contato com as soluções. Outros grupos podem medir o PD no chão nasal, que é tecnicamente mais fácil. Importante, Vermeulen (2011) demonstrou que os 2 métodos são comparáveis16.
O aquecimento das soluções, é uma questão de debate entre europeus e centro-norte-americano de17,18. Tem sido advogava que usar soluções a 37 ° C, em vez de 22 ° C aumenta a resposta de cloreto total observado por cerca de 25% e a resposta de isoproterenol dependentes cloreto por aproximadamente 95%18. No entanto, o aquecimento aumenta variabilidade, avaliada pelo maior desvio padrão do cloreto total resposta17. Portanto, como o aquecimento das soluções é um factor adicional de variabilidade, é aconselhável não aquecer as soluções, a menos que exigido em uma base de estudo.
Temos anteriormente em relação a ambas as técnicas de eletrodo e encontrado que o AgCl e o calomelano sistemas de eletrodo operavam da mesma forma nas correntes basais e estimuladas em indivíduos normais,13.
Limitações da técnica
Este teste está sujeito a significativa dentro de variabilidade. A variabilidade de marcar um gol é especialmente prevalente em pacientes com traçados indeterminados e este deve ser contabilizado no aplicativo de diagnóstico19. Fatores de variabilidade incluem infecção aguda do trato respiratório superior, extensa polipose nasal, cirurgia prévia do seio e CF-relacionados a inflamação, que diminuem a sua especificidade e sensibilidade20,10. Além disso, interpretação de traçados pode ser diferente entre os leitores, embora leitores especialistas demonstram excelente acordo de Pontuação quantitativa e interpretabilidade em CF e traçados não-CF, contrastando com uma variabilidade significativa na confiança dos rastreamento19.
Variabilidade intrínseca contra limiares significativos
Muito importante, a variabilidade fisiológica da medição é considerável, como ilustrado em diferentes estudos10, tais como os testes de terapia do gene CFTR que demonstrou variabilidade considerável em mudanças no transporte total de cloreto e amilorida variam de21,22. Avaliação transversal sugere que zero Cl– além disso isoproterenol resposta acima do limiar de -5 a -7 mV é o limite entre CF e assuntos não-CF10.
No entanto, carecemos de conhecimento claro sobre a magnitude da mudança desse parâmetro, que representa uma correção de CFTR eficaz em ensaios de fase II com doença modificando terapias. Para avaliar a resposta individual, repetidos testes de monitoramento da resposta a uma intervenção podem ser necessária para distinguir alterações significativas da variabilidade intrínseca. Muito importante, futuros estudos de longo prazo com doença modificando drogas precisam demonstrar que melhora da função CFTR correlaciona-se com melhoria nos resultados clinicamente relevantes ou substituto resultados (tais como a melhoria no VEF1) da CF doença. Com efeito, uma recente fase II Ivacaftor estudo demonstrou marcada benefício clínico, apesar de uma pequena melhoria da secreção de cloreto23.
Esses estudos irão ajudar a estabelecer-se um valor de corte de melhoria na condutância de Cl–trans-epitelial pode ser um parâmetro substituto para benefício clínico. Isto seria um parâmetro importante para orientar o desenvolvimento de CFTR modificando terapias.
Importância no que diz respeito a métodos existentes: teste de suor e medições atual Intestinal (ICM)
Em pacientes com ‘ questionável ‘ fibrose cística, como avaliado por um intermediário suor Cl– concentração entre 30 e 60 mM, golo de NPD composto fornecido uma ferramenta altamente sensível para diagnosticar pacientes como ‘CF-provável ‘ e ‘ CF-improvável ‘10 . Medição atual intestinal (ICM), que fornece uma medição ex vivo do líquido Cl– fluxos através do epitélio retal, também permite determinação da função CFTR residual com uma alta sensibilidade porque CFTR é altamente expresso em Este epitélio.
Considerando a modificação da função CFTR por moduladores CFTR, a relação entre estes diferentes alterações de biomarcador CFTR é actualmente pouco claras. Apesar de recente trabalho baseado em Ivacaftor determinou que teste NPD e suor são correlacionados4, não ainda estabeleceu-se uma medição no tracto respiratório é melhor preditor de resultado respiratório do que, por exemplo, o suor teste24 , 25 ou mudança na ICM. Além disso, drogas de modificador também podem diferir em suas eficácias específicas do órgão. Em relação a NPD, é importante notar que as alterações em resposta basal de PD e amilorida expressam transporte at+ , enquanto mudanças no Cl 0– e o isoproterenol resposta expressam transporte Cl– . É ainda necessário estabelecer qual delas é mais importante para a melhoria da doença.
Futura aplicação desta técnica
O uso desta técnica é esperado fora do campo de CF. Uma vez que esta técnica é excepcionalmente adequada para demonstrar at+ e Cl– canal iônico, que pode ser aplicado para demonstrar a disfunção em doenças de vias respiratórias, incluindo asma26, bronquite crônica,27, não-CF Bronquiectasia28 e pancreatite recorrente29. Além disso, modificações desta técnica tem sido usadas nas vias aéreas inferiores (LAPD) para demonstrar a disfunção centrada em vias aéreas inferior CFTR em portadores de doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) bronquite crônica30.
NPD fornece um biomarcador sensível na vivo da função CFTR, o que pode ser usado tanto no diagnóstico e, também, para estudos de prova de conceito, com o objetivo de corrigir CFTR e ENaC canal atividade em pesquisa translacional. Isto permite a avaliação longitudinal da função trans-epitelial e é uma promessa como estratégia de medicina personalizada costurar o corrector mais eficiente para cada paciente com FC.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo grupo de trabalho para a função de CFTR do Comitê de padronização (rede de ensaios clínicos, da sociedade europeia de fibrose cística) e o grupo nacional de recursos centro trabalhando (rede de desenvolvimento de terapêuticas, fibrose cística Fundação). Apoio adicional foi fornecido pela Fundação CF (Clancy FY09 para GMS) e NIH (DK072482 para ARM e GMS).
Materials
| KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital) | Fisher Scientific | ||
| Powerlab 4/30 | AD Instruments | ||
| BMA-200 AC/DC portable bioamplifier | AD Instruments | ||
| IS0-Z isolation headstage for BMA-200 | AD Instruments | ||
| Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher | Various | ||
| AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher | AD Instruments | ||
| ECG electrode (ground for study subject) | Hospital standard | ||
| 2 mini calomel reference electrodes | Fisher Scientific | 13-620-79 | |
| Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm | Spectrum | ||
| Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.) | Hospital standard | ||
| 2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode | BIOPAC Systems | UNSHLD-EL258 | |
| 2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm | SLE Instruments | ||
| Signacreme® Conductive Electrode Cream | Fisher Scientific | Parker Labs ref # 17-05 | |
| Skin abrasion device | PROMED Feeling | Ref 374901 | |
| Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs | Ash Instruments | ||
| Becton Dickinson PE 50 tubing | Fisher Scientific | 427411 | |
| Becton Dickinson PE 90 tubing | Fisher Scientific | 427421 | |
| Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD | Fisher Scientific | 508-007 | |
| Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m) | 3M | 1530-1 | |
| Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US | Marquat | I0202US | |
| 1" X 10 yards silk tape | 3M Durapore | 1538-1 | |
| IV extension tubing (30", 50/box) | International Limited | IMN30 | |
| Three-way stopcock (50/box) | Medex | MX5311L | |
| Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent) | Fisher Scientific | 09-926-7 | |
| Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 427564 | |
| Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site) | Fisher Scientific | 367283 | |
| Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box) | Fisher Scientific | 309653 | |
| Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box | Fisher Scientific | 309604 | |
| Single use sterile wipes (per institutional availability) | Hospital standard | ||
| 70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
| Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable) | Fisher Scientific | 430624 | |
| Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
| Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
| Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration | Fisher Scientific | ||
| Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard) | SureCare | ||
| 23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box) | Becton Dickinson | 367283 | |
| Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent) | Fisher Scientific | ||
| Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent) | Fisher Scientific | ||
| Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery | Fisher Scientific | ||
| Head and chin rest (or equivalent; optional) | Richmond Products, Inc | 629R | |
| Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent) | Fisher Scientific | No. 791 | |
| REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE | |||
| Sodium Chloride, Granular – USP NaCl | Spectrum | Formula Weight: 58; Size: 500 gm | |
| Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 147; Size: 500 gm | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
| Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP | Spectrum | Formula Weight: 174; Size: 500 gm | |
| Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4) | Spectrum | Formula Weight: 136; Size: 500 gm | |
| Sodium Gluconate- USP (monosodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 218; Size: 500 gm | |
| Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder) | Spectrum | Formula Weight: 430; Size: 500 gm | |
| Potassium Gluconate- USP (Anhydrous) | Spectrum | Formula Weight: 234; Size: 500 gm | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O | Spectrum | Formula Weight: 246; Size: 500 gm | |
| Amiloride HCl – USP | Spectrum | Formula Weight: 302; Size: 5gm | |
| Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt) | Spectrum | Formula Weight: 551; Size: 5gm | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O | Spectrum | Formula Weight: 203; Size: 500 gm | |
| Double-distilled water (ddH2O) | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 1 L | |
| Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule | Hospital Pharmacy | Formula Weight: 248; Size: single use | |
| Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation | Hospital Pharmacy | Formula Weight: NA; Size: 5 L |
Referencias
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