Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD)

George M. Solomon; Inez Bronsveld; Kathryn Hayes; Michael Wilschanski; Paola Melotti; Steven M. Rowe; Isabelle Sermet-Gaudelus

doi:10.3791/57006

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Medicina

Standardisierte Messung der Nasenschleimhaut berührt Potential Unterschied (NPD)

Published: September 13, 2018

doi:

10.3791/57006

George M. Solomon¹, Inez Bronsveld², Kathryn Hayes³, Michael Wilschanski⁴, Paola Melotti⁵, Steven M. Rowe¹, Isabelle Sermet-Gaudelus^6,7

¹Department of Medicine and the Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center,University of Alabama at Birmingham, ²Department of Pulmonology and Tuberculosis,University Medical Center Utrecht, ³Center for Experimental Medicine,Queens University, Northern Ireland, ⁴Hadassah Hebrew University Medical Center, Jerusalem, ⁵Centro Fibrosi Cistica,Azienda Ospedaliera Universitaria Integrata, ⁶Service de Pneumologie et Allergologie Pédiatriques and Center de Ressources et de Compétence de la Mucoviscidose,Hôpital Necker Enfants Malades, ⁷INSERM U 1151,Institut Necker Enfants Malades

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein standardisiertes Protokoll um die nasale Potentialdifferenz (NPD) zu messen. Zystische Fibrose transmembranen Leitwert Regulator (CFTR) und epitheliale Natrium-Kanal (ENaC)-Funktion werden ausgewertet von der Änderung in der Spannung über die nasale Epithel nach Superfusion von Lösungen, die Ionen-Kanal Aktivität ändern vorausgesetzt, eine Ergebnis Maßnahme.

Abstract

Wir beschreiben eine standardisierte Messung des nasalen Potentialdifferenz (NPD). Bei dieser Technik werden Mukoviszidose transmembranen Leitwert Regulator (CFTR) und die epithelialen Natrium-Kanal (ENaC) Funktion durch die Änderung der Spannung über die nasale Epithel nach der Superfusion Lösungen überwacht, die Ionen-Kanal ändern Aktivität. Ermöglicht wird das durch die Messung der Potentialdifferenz zwischen dem subkutanen Depot und die Atemwege Epithel in das Nasenloch, mit Hilfe eines Katheters in Kontakt mit den minderwertigen Nasal Nasenmuschel.

Der Test ermöglicht die Messung von stabilen Basislinie Spannung und die aufeinanderfolgenden net Spannungsänderungen nach Perfusion von 100 µM Amilorid, ein Inhibitor der Na⁺Resorption im Ringer Lösung; ein Chlorid-freie Lösung Amilorid, Laufwerk-Chlorid-Sekretion und 10 µM Isoproterenol in einer Chlorid-freie Lösung mit Amilorid, zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) zu stimulieren-abhängigen Chlorid Leitwert im Zusammenhang mit CFTR.

Diese Technik hat den Vorteil die elektrophysiologischen Eigenschaften von zwei wichtige Komponenten, die zur Gründung der Hydratation der Atemwege Oberfläche Flüssigkeit des respiratorischen Epithels, ENaC und CFTR zu demonstrieren. Daher ist es ein nützliches Recherchetool für Phase 2 und Nachweis der Konzept-Studien von Agenten, die auf CFTR und ENaC Aktivität für die Behandlung von Lungenerkrankungen Cystische Fibrose (CF). Es ist auch ein Follow-up-Verfahren, CFTR-Dysfunktion zu etablieren, wenn genetische Tests und Schweiß nicht eindeutig sind. Im Gegensatz zu Schweiß-chlorid ist der Test relativ zeitaufwendig und kostenintensiv. Es erfordert auch Operator-Ausbildung und Expertise für den Test effektiv. Inter – und intra – subject Variabilität wurde in diese Technik vor allem in jungen oder unkooperativen Themen berichtet. Um dieses Anliegen zu unterstützen, wurde Auslegung durch eine vor kurzem validierte Algorithmus verbessert.

Introduction

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die nasale Potentialdifferenz (NPD) zu messen, die Trans-epithelialen Ionen-Transport in Vivo¹untersuchen soll. Diese Technik ermöglicht die Messung von Natrium (Na⁺) und Chlorid (Cl^–) Transport. NPD wurde wird seit den späten 1980er Jahren als Recherche-Tool und im Jahr 1998 als ein diagnostisches Verfahren durch die Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Konsens Anweisung² und im Jahr 2017 in der Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Konsens diagnostische Leitlinien ³. biologische CFTR-Dysfunktion, die die Ursache von CF, zeigt sich in der Tat durch eine erhöhte Na⁺-Absorption in der apikalen Membran und einen Defekt in Cl^– -Sekretion. Dieser Funktionstest bietet den Vorteil eines zusätzlichen Diagnose-Tools bei der Genetik bei Patienten mit unbestimmten intermediate Schweiß-Test Ergebnisse³nicht schlüssig ist. Obwohl diese Informationen auch von Darm aktuelle Messung Biopsien (ICM) bezogen werden kann, ICM ist jedoch nur verfügbar in einigen wenigen Zentren weltweit und benötigt weitere Standardisierung. NPD ist in ca. 60 globalen Zentren mehr verfügbar und darüber hinaus richtet sich das respiratorische Epithel, das am Hauptstandort der Krankheit ist.

Auf CFTR-Aktivität bereitgestellten Informationen gegeben, ist es auch in Proof-of-Concept-Studien mit dem Ziel, funktionelle Wiederherstellung des CFTR-Protein bewerten von Modulator Therapien⁴^,⁵^,⁶^,⁷^verwendet, ⁸. In der Tat, Daten aus Studien mit CFTR-mRNA/gen bearbeiten, CFTR Potentiator und Korrektor Therapien, markieren signifikante Veränderungen in Cl^– und Na⁺ transport mit Therapie⁶^,⁹ und bestätigt, dass die NPD sein kann eine reaktionsschnelle Endpunkt in klinischen Studien. Da wir sensible klinische Endpunkte eine subtile Veränderung im klinischen Zustand des Patienten zu erkennen, nur kurzfristig fehlt, könnte dieser präklinischen Biomarker sehr informativ sein. Bereich der CFTR-Modulator Therapien erweitert schnell und wir brauchen dringend Tests in Vivo , die Wirkstoffe schnell entschlüsseln, bevor Sie gehen auf große Phase 3 Studien¹⁰.

Die physiologische Begründung der Technik basiert auf der Messung der Potentialdifferenz zwischen den Atemweg Epithel in das Nasenloch und das subkutane Fach. Ion Channel-Aktivitäten werden durch die stabile maximalen Basislinie Potentialdifferenz (PD), seine Veränderungen nach Sperrung der ENaC Na⁺ Absorption im Zusammenhang mit Messen und Cl^– -Sekretion über verschiedene apikalen Cl^– -Transporter fahren erforscht einschließlich der CFTR. CFTR-Dysfunktion zeigt sich durch eine minimale Änderung in Potentialdifferenz nach Stimulation der Cl^– -Sekretion durch eine cAMP abhängige Bahn und eine erhöhte ENaC vermittelt Na⁺ Absorption durch eine negativere Grundlinie Potentialdifferenz erkannt und eine verbesserte Reaktion auf Amilorid. Die mechanistische Grundlage für CF im Vergleich zu normalen PD ist in Abbildung 1zusammengefasst.

Abbildung 1: zusammenfassende Abbildung des Ionenkanals Aktivität. (A)-Ionen-Aktivität in der respiratorischen Epithels demonstrieren ausgeglichen Aktivität der ENaC und CFTR in gesunden Probanden und (B) Verlust von CFTR-Aktivität wiederum erhöht ENaC vermittelte Natrium Transport und reduziert CFTR-abhängigen Chlorid Transport. ENaC: epitheliale Natrium-Kanal, Na⁺: Natrium, CFTR: Mukoviszidose transmembranen Regler, CL^–: Chlorid, mV: Millivolt, PD: Potentialdifferenz, min: Minute/s Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Dieser Test zeigt jedoch ein gewisses Maß an Variabilität sowohl bei wiederholten Messungen innerhalb des gleichen Patienten und bei Patienten mit der gleichen Genotyp. Dies ist von größter Bedeutung für die Interpretation der Veränderungen nach Modulator Behandlung zu erleichtern. Darüber hinaus fehlen uns noch validierte Schwellen zwischen CF und gesunden Probanden unterscheiden. Dies kann teilweise aufgrund der Unterschiede zwischen der Verfügbarkeit von klinischen Einrichtungen und die Techniken beschäftigt sein. Daher läuft ein erheblichen internationalen Bemühungen zur Standardisierung des Tests. Die uns CFF-TDN (Cystic Fibrosis Foundation-Therapeutika Development Network) und der Eigenkapitalfonds-CTN (European Mukoviszidose Gesellschaft-Clinical Trials Network) ein NPD-Standard Operating Procedure (SOP) für den Einsatz in der multizentrischen und Forschung Studien erstellt. Diese jüngsten Zusammenarbeit durch die CTN und TDN führte in einer kombinierten, internationale SAA, die Expertise der CTN und TDN zusammenführt (2014)¹¹. Dieser Beitrag stellt die Protokoll und Test Techniken, NPD für CF-Diagnose oder wissenschaftsinitiierten Proof-of-Concept-Studien zu beschäftigen. Jedes Zentrum Umsetzung der Technik ist verantwortlich für die Anwendung seiner institutionellen Humanforschung Ethikkommission zur Genehmigung.

Abbildung 2: Schematische Darstellung des gesamten empfohlen NPD Setup. Beachten Sie, dass das empfohlene Setup angezeigt wird, einschließlich der sequentiellen Perfusion Pumpen und das 4-Absperrhahn Serie-Setup. Bestimmte Verbindungen und Beispiele für Komponenten entnehmen Sie bitte der SOP. (Abbildung mit freundlicher Genehmigung von Solomon, G.M Brust, 2010¹³geändert) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Die allgemeine experimentellen Ablauf ist in Abbildung 2skizziert wobei NPD zwischen erkunden Brücke positioniert auf der Epithel-Oberfläche und Referenz-Brücke platziert in den subkutanen Raum, beide Elektroden und einem hochohmigen verbunden gemessen wird Voltmeter.

Dies wird gewährleistet durch 2 verschiedene Systeme: Es gibt 2 akzeptabel Referenz-Elektrode-Setups: (i) ausgewogen Ag/AgCl-Elektroden und eine Elektrokardiogramm (EKG) Creme gefüllten Brücke an den subkutanen Raum durch leichte Abrieb oder (Ii) gesättigt Kalomel Halbzellen und eine Agar gefüllt 22 – 24-Gauge Nadel subkutan eingeführt. Der Kontakt mit der Nasenschleimhaut wird durch einen Doppel-Lumen Katheter ermöglicht. Ein Lumen mit Agar oder ECG Creme gefüllt und an die Messelektrode angeschlossen ist, zum anderen ermöglicht Perfusion auf die Nasenschleimhaut der verschiedenen Lösungen.

Die Spitze der Erforschung Schläuche befindet sich auf der respiratorischen Schleimhaut unter die minderwertige nasale Nasenmuschel (Abbildung 3).

Abbildung 3: Platzierung der Schläuche auf respiratorischen Schleimhaut zu erforschen. (A) Außenansicht anzeigen Platzierung. (B) Rhinoscopic Ansicht demonstrieren Platzierung. (C) Diagramm Angabe der anatomischen Lage für die Platzierung des Katheters. PD: Potentialdifferenz

Um die Reaktion der PD auf mehrere Drogen zu untersuchen, werden die superfusion Lösungen über das zweite Lumen des Katheters appliziert. Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Vorbereitung und Durchführung der NPD Messungen, die in das Protokoll von der anfänglichen Vorbereitung durch Datenanalyse unten detailliert sind.

Nach der Zubereitung von Lösungen und Elektroden kann geeignete Qualitätsprüfung der Elektroden und Kathetern für das grundlegende Verhalten des Tests. Basalen Messungen entlang der unteren Nasenmuschel, die Auswahl der besten Ort für Messung ermöglicht, in der Regel, mit der negativsten Messung. Dann bestimmen sequentielle Perfusionen Na⁺ (ENaC) und Cl^– (CFTR-abhängige) Ionen-Fluss über eine Änderung in der Spannung über die nasale Epithel.

Protocol

Das Protokoll am Menschen wurde von allen beteiligten Institute Research Committee genehmigt. Jedes Zentrum Umsetzung der Technik ist verantwortlich für die Anwendung seiner institutionellen Humanforschung Ethikkommission zur Genehmigung. 1. Vorbereitung der Lösung Bereiten Sie Lösungen #1, #2 und #3, die sind Basislösungen in 1 L Chargen vor der Prozedur und gespeicherte vor Ort (Tabelle 1).Hinweis: Amilorid ist lichtempfindlich und muss im Dunkeln aufbewahrt werden (siehe Tabelle 1 für die Zusammensetzung der Lösung) (siehe SOP für detaillierte Lösung Vorbereitung11). Alle Lösungen bei pH 7,4 und Filter mit einem 0,22 µm Flaschenverschluss Filter zu puffern. Lösung #3 zuerst die phosphathaltigen Salze hinzufügen, damit sie ionisieren um Kristallisation (siehe Tabelle 2 für Lösung Zusammensetzung) zu verhindern.Hinweis: Die Reihenfolge der Mischung ist entscheidend für die Lösung #3. Speichern Sie diese Lösungen bei 4 ° C (stabil für 3 Monate) oder bei-20 ° C (stabil für 6 Monate). Bereiten Sie Lösungen #4 und #5 durch Hinzufügen von Agents am Tag der NPD-Prüfung vor. Isoproterenol ist Licht und Oxidation empfindlich und es verliert seine Tätigkeit bei Raumtemperatur (Demonstration 4 % Verfall über 4 h bei 4 – 8 ° C). Shop bei 4 ° C.Hinweis: ATP ist Licht und Oxidation empfindlich (siehe Tabelle 3). Verbindung Molekulargewicht Konzentration (mM) Zusammensetzung (g/L) NaCl 58 148 8,58 CaCl2 2 H2O 147 2.25 0,33 KCl 75 4.05 0,3 K2HPO4 174 2.4 0,42 KH2 PO4 136 0,4 0.05 MgCl2 6 H2O 203 1.2 0,24 Tabelle 1: Lösung Zusammensetzung. Verbindung Molekulargewicht Konzentration (mM) Zusammensetzung (g/L) Na-Gluconat 218 148 33.26 Ca Gluconate 430 2.25 0,97 K-Gluconat 234 4.05 0.95 K2 HPO4 174 2.4 0,42 KH2 PO4 136 0,4 0.05 MgSO4 7 H2O 246 1.2 0,24 Tabelle 2: Lösung Zusammensetzung. Lösung Lösung Nummer Inhalt EDC-Mark Klingeltöne-Injektion Lösung #1/A Gepufferte Klingeltöne für die Injektion KLINGELTÖNE Klingeltöne + Amilorid Lösung #2/B Gepufferte Klingeltöne + 100 μM Amilorid AMIL Cl– + Amilorid auf NULL Lösung #3/C Gepuffert, NULL Cl– + 100 μM Amilorid OCL Cl– + Amilorid + Isoproterenol auf NULL Lösung #4/D Gepuffert, NULL Cl– + 100 μM Amilorid + 10 μM isoproterenol ISO NULL-Cl–, Amilorid, Isoproterenol + ATP Lösung #5/E Gepuffert, NULL Cl– + 100 μM Amilorid + 10 μM Isoproterenol + 100 μM ATP ATP Tabelle 3: Lösung Liste. (2) Katheter Verwenden Sie eine PVC, STERIL, einzelne Nutzung, 2 Lumen (0,7 mm innerer Ø) Katheter mit einer Runde und glatte Extremität (2,5 mm Außen Ø), die speziell für die NPD. Knüpfen Sie Kontakte mit der Schleimhaut durch eine seitliche Öffnung, 2 mm weit an der Spitze mit einem Loch an der Spitze für die Perfusion (siehe Punkt 10.1). Eine der beiden Luer-Lock-Verbindungen des Katheters an die Messelektrode und das andere zur Perfusion Pumpe anschließen. Verwenden Sie den Kanal in blau als die Messung Lumen gebeizt. Markieren Sie den Katheter bei jedem Intervall 0,5 cm, 10 cm.Hinweis: Der Totraum ist 0,3 mL. Es ist vorzuziehen, das oben beschriebene Verfahren verwenden, für die Vorbereitung des Katheters ist dies nicht möglich, folgen die nächsten beiden Schritte. Schnittlängen von PE50 und PE90 Katheter Schlauch gleich (~ 76 cm). Kleben Sie diese zusammen in einem 1 cm Stück Silizium Gummischlauch. Legen Sie eine 25 G stumpfe Spitze Nadel Snuggly in das entgegengesetzte Ende des Schlauches PE-90. Legen Sie eine 25 G Schmetterling Nadel Snuggly in entgegengesetzten Ende des PE50 Schläuche und achten Sie nicht auf den Schlauch zu durchbohren, da es platziert wird. Abbildung 4: Katheter für NPD-Messungen verwendet. Objektrahmen zeigt die Katheterspitze mit Mess Loch. 3. Vorbereitung der Agar-Haut-Brücke (Butterfly-Nadel) und Katheter Hinweis: Die Manipulation des geschmolzenen Nährbodens kann zu Verbrennungen führen, und dies sollte mit Vorsicht erfolgen. Bereiten Sie 3 % Agar durch Mischen von 3 g Agar mit 100 mL Lösung #1 in einer breit-Mund-Flasche. Schmelzen der Agar in der Mikrowelle bis löslich (transparent). Füllen Sie 10 mL Spritze mit warmen Agar. Verbinden Sie die Spritze anschließend mit Butterfly-Nadel (23 G) und die markierten Lumen des Katheters. Der Agar zu injizieren, bis es an der Spitze angezeigt wird. Für mindestens 10 Minuten abkühlen lassen. Stellen Sie sicher, dass die Haut-Brücke und der Katheter vollständig gefüllt und visualisiert, um frei von Luftblasen sein. Die lose Haut Brücken in Lösung #1 bei 4 ° C zu lagern und nach 1 Woche nicht mehr verwenden. 4. wenn Using ECG Creme Verdünnen Sie die ECG-Creme mit Lösung #1 (1:1, V/V Ringer). Bis frei von Luftblasen ruhen lassen. Füllen Sie 10 mL Spritze mit verdünnter ECG-Creme. Verbinden Sie die Spritze mit der markierten Lumen des Katheters und injizieren Sie langsam die ECG-Creme, bis es in das untere Loch der Seite erscheint. Stellen Sie sicher, dass der Katheter vollständig gefüllt und frei von Luftblasen ist. 5. Datenerfassungssystem Hinweis: Die allgemeine Einstellungen für das Datenerfassungssystem ist in Abbildung 5dargestellt. Abbildung 5: richten Sie das Datenerfassungssystem. Anschlüsse der Bioamplifier und Headstage an die Computerschnittstelle sowie die Elektrode Anschlüsse an der Headstage11demonstrieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Verbindungen Verbinden Sie den Computer mit dem Datenerfassungssystem (Table of Materials) mit einem USB-Kabel. Um das Datenerfassungssystem mit der Bioamplifier verbinden, schließen Sie das BNC-Kabel aus dem Kanal 1 Eingang auf das Datenerfassungssystem (vorne) an den Ausgang der Bioamplifier (hinten). Schließen Sie die Bioamplifier an der Headstage mit einem benutzerdefinierten Kabel bereits angeschlossen an die Headstage Schrauben in der Eingangsteil an der Vorderseite der Bioamplifier. Schließen Sie die Headstage an den Elektroden und der Masseelektrode. Verwenden Sie standard 2 mm Buchse-Buchse-Stecker an um die Vorderseite des Headstage an die Elektroden zu verbinden.Hinweis: Der Hafen ist versenkt und passt nur eine Richtung der 2 mm-Kabel: rot-messende Elektrode auf die Patienten Nase (über nasale Katheter); Schwarz-Bezugselektrode zur Haut des Patienten Brücke; White, ECG Elektrode an Subjekts Haut geerdet. Stellen Sie die Bioamplifier wie beschrieben: Offset: Pull zu aktivieren, wenden sich an anzupassen, lassen Sie zog nach Anpassung; Spannung: DC; 1 mV-cal: neutrale Position; Leistung: Auf um Daten zu sammeln, ausschalten Sie, um Batterie aufzuladen; Gewinn: setzen Sie auf 10; Bandpass: LoFreq (Outer Knopf): DC; Bandpass: HighFreq (innere Knopf): 1kHz; Volumen: ab. 6. Einstellung den Kopf-Bühne-Offset Schließen Sie den Laptop und den Verstärker in der Reihenfolge, wie in der SOP11abgebildet. Schalten Sie das Datenerfassungssystem und dann den Laptop (die Reihenfolge ist wichtig, dass die Software das Gerät für die Datenerfassung zu erkennen). Passen Sie die Leiter-Bühne Offset gemäß der SOP-Sequenz. 7. die offsets Hinweis: Es gibt mehrere Offsets zu getestet werden, um die Stabilität des elektrischen Mess-Systems zu gewährleisten. (siehe Abbildung 6) Legen Sie für die Elektrode zu versetzen die Referenzelektrode (negativ) und (positive) Messelektrode in die verdünnte ECG-Creme oder die 3 M KCl. Achten Sie darauf, das die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden zu lesen in der Nähe von NULL auf der Headstage ist. Legen Sie für die Festlegung des Katheter und/oder Haut-Brücke-Offset Luer-Lock Ende der nasalen Katheter oder Luer-Lock Ende der Haut-Brücke in das Bad mit der Messelektrode (positiv). Legen Sie das andere Ende des Katheters in die ECG Creme Bad oder 3 M KCL, enthält die Referenz (negative) Elektrode um sicherzustellen, dass die Potentialdifferenz in der Nähe von NULL auf der Headstage ist. Um einen closed-Loop-Offset einzurichten, sicherzustellen Sie, dass der Stromkreis geschlossen ist, wenn die nasale Katheter in das Bad der Elektroden zu ersetzen. Überprüfen Sie, dass der geschlossene Kreislauf liest in der Nähe von 0 ausgeglichen mV (= “offset”; ±2.5 mV). Passen Sie den Headstage Offset Regler, um den Versatz auf 0 bringen mV.Hinweis: Dies bestätigt, dass alle Verbindungen innerhalb der Schaltung intakt sind. Wenn dies nicht der Fall ist, möglicherweise der nasale Katheter nicht intakt (Luftblasen in den Agar oder die ECG-Creme). Ändern der Agar-Brücke, oder drücken Sie die ECG-Creme im Setup. Der Elektrode Offset muss durchgeführt werden, zuerst, gefolgt von der geschlossenen System (closed-Loop-Offset) mit der Elektrode und der Brücke (Abbildung 6). Abbildung 6: Einrichtung von (A) Elektrode Offset, (B) Katheter (oder Brücke) Offset (C)-Closed-Loop-Offset. (8) Spritze Set-up Hinweis: Das folgende ist die empfohlene Einstellung. Tauen Sie Lösungen #1, #2 und #3 ca. 1 h vor der Messung. Schließen Sie die Hilfslinie an den Absperrhahn am nächsten an den Katheter. Schalten Sie alle Pumpen und spülen Sie den Katheter mit Lösung #1, vollständig aus dem Katheter zu spülen, bis Hähne frei von Luftblasen sind. 9. die Platzierung des Referenz- und Messung Elektrode Abbildung 7: Thema mit Mess-Elektrode und subkutane Brücke bereit für Messungen. Haben Sie die Studie Thema eine sitzende Position mit Blick auf die NPD-Betreiber nehmen. Legen Sie für mehr Komfort die Füße auf die optionale antistatische Matte und Kopf auf die Orthoptic kinnstütze. Verbinden der Masseelektrode Blei ECG-Pad platziert auf das Thema Arm (Abbildung 7). Subkutane Nadel in den dorsalen Unterarm (Agar-System) oder das EKG Creme auf einer zuvor minimal abgeschliffene Fläche auf dem Unterarm die Bezugselektrode zuweisen (siehe Nrn. 7 bis zu 10 unten). Überprüfen Sie die Verbindung zu den subkutanen Raum durch die Messung der Potentialdifferenz mit der Haut (Finger PD) und Fragen, das Thema, das “Mess Loch” in der Nähe des Katheters zwischen der Spitze der seinen Daumen und Zeigefinger einklemmen. Wenn die Finger PD nicht-30 mV oder mehr negative, die Einfügung der Schmetterling Nadel zu überprüfen. Wiederholen Sie den Abrieb (für ECG Creme Set-up) und überprüfen Sie Brücken zu. Starten Sie die Lösung #1 Spritzenpumpe um 80 mL/h Start mit dem rechten Nasenloch. Die Finger-PD als eine stetige negative Spannung zu messen (typische Reichweite-40 bis-80 mV). Wenn die Creme-EKG-System zu verwenden: die ECG Sahne 1:1 verdünnen und füllen Sie den Katheter nach einem kompletten Flush aus aus der Sonde Bohrung wie zuvor für den Agar gesehen. Schließen Sie den Katheter an eine 50 mL Spritze halb gefüllt mit der ECG-Creme, die Elektroden, so dass eine Überprüfung der Elektrode-Offset und die Brücke aus zu Baden. Verbinden des Verweis Ag/Cl-Elektrode auf den subkutanen Raum durch leichte vorherigen minimaler Abrieb der Haut, die Haut erscheint, “Rosa und glänzend” Wenn das Niveau der Dermis erreicht. Positionieren Sie die Messelektrode mit ECG-Creme auf die abgeriebenen Haut bedeckt. Überprüfen Sie den Finger PD wie zuvor für das Agar-System angezeigt. 10. die Messung des basalen PD Legen Sie die nasale Katheter in das rechte Nasenloch mit einem leuchtenden Rhinoscope (oder gleichwertig) um die untere Nasenmuschel zu visualisieren. Mit der vorderen Spitze als Wahrzeichen, vorab den Katheter auf minderwertige Ortsbild des der unteren Nasenmuschel auf die Schleimhaut der Atemwege. Alternativ kann die Platzierung schwierig ist, die Sonde Loch Kontakt mit dem Boden des Nasenlochs platziert werden.Hinweis: Der Katheter ist steif genug, um in das Nasenloch durch den Betreiber geführt werden. Um die Platzierung zu erleichtern, einen Kanal des Katheters ist in blau gefärbt und enthält die Sonde-Bohrung in Kontakt mit der unteren Nasenmuschel. Dies verhindert, dass Katheter Drehung. Die Markierungen auf den Katheter von 1 bis 10 cm angegeben bieten einfach Referenzpunkte. Messen Sie die PD an der unteren Nasenmuschel. Sicherzustellen Sie zu diesem Zweck, dass das Messgeräte Loch des Katheters durch seine Platzierung gegen die Schleimhaut der unteren Nasenmuschel (Marke rechts Basal) geschlossen ist. Messen die PD auf 3.0, 2.0, 1.5, 1,0 und 0,5 cm (Abstand innerhalb der minderwertigen Meatus aus der unteren Nasenmuschel): Markieren Sie rechts Basal PDs. Halten Sie jede Messung im angegebenen Abstand für ca. 5 s, gewährleisten eine stetige Lesung (± 1 mV) und genaue Interpretation der basalen PD-Werte zu erleichtern. Wiederholen Sie die Schritte oben in der linken Nasenloch, mit der Funktionstaste linken basale PDs (3 cm, 2 cm, etc.) und Links Basal zu markieren. Basalen PD Maßnahmen als Leitfaden verwenden, führen Sie die Sonde des nasalen Katheters auf der Website der negativsten Signal (bis zu 3 cm von der vorderen Spitze des die minderwertige nasale Nasenmuschel), und sicher mit einem kleinen Stück Klebeband an der Spitze der Nase (oder Äquivalent). 11. die Ablaufverfolgung sequentielle Perfusionen NPD Für das rechte Nasenloch Stellen Sie sicher, dass die Lösung aus der Patient Nase tropft. Haben Sie das Thema eine bequeme Position mit dem Kopf nach unten zu übernehmen (oft durch das Thema ruhen, den Kopf auf ihre Hand oder verwenden Sie einen Kinnhalter oder anderen bewegungseinschränkenden geholfen). Erinnern Sie das Thema, die Bewegung zu minimieren und berühren Nase oder den Schlauch und sprechen zu vermeiden. Lösung #1 drehen (Klingeltöne) Pumpe (5 mL/min oder 300 mL/h). Aufnehmen, bis Sie ein stabiler Wert erhalten (< 1 mV Änderung/30 s).Hinweis: Dies dauert ca. 3 min, Stabilität zu erreichen. Schalten Sie die Durchblutung mit Lösung #1. Die Perfusion mit Lösung #2 (Amilorid) beginnen. NPD für ein Minimum von 3 min aufnehmen (wenn die Plateau-Spannung in Frage steht, fahren Sie die Aufzeichnung für insgesamt bis zu 5 min). Beginnen Sie die Durchblutung mit Lösung #3 (null-Chlorid). NPD für ein Minimum von 3 min aufnehmen (wenn die Plateau-Spannung nicht stabil ist, fahren Sie die Aufzeichnung für insgesamt bis zu 5 min). Die Perfusion mit Lösung #4 (Β1) beginnen. NPD für ein Minimum von 3 min aufnehmen [Wenn die Plateau-Spannung nicht stabil ist (eine stetige Spannung Ablaufverfolgung für mindestens 30 s < 1 mV Drift), weiterhin die Aufzeichnung für insgesamt bis zu 5 min]. Beginnen Sie die Durchblutung mit Lösung #5 (ATP). Rekord NPD für ein Minimum von 1 min, bis man ein Spitzenwert hyperpolarizing Antwort erhält. Schalten Sie die Durchblutung mit der Lösung #1 (Klingeltöne) und lassen Sie 30 s, den Katheter zu spülen. Schalten Sie die Lösung #1-Perfusion. Wiederholen Sie den Vorgang für die linke Nasenloch. 12. Ende des Tests Überprüfen Sie und notieren Sie stabile Finger PD (“Post-Finger”) für 5 s. Das Thema kutane Brücke und den Verband aus der Einstichstelle auf der Haut zu entfernen. Entfernen Sie für die Creme-AgCl/EKG-System die Elektrode aus dem Arm. Die “Endgültige geschlossen Loop Offset” Spannung aufzeichnen, wie beschrieben zur Messung des ersten closed-Loop-Offset (siehe Schritt 7.1.3). Mark letzte Offset mit der Funktionstaste. Datenerfassung zu stoppen (drücken Sie “Start””).Hinweis: Die aktuellen SOP empfiehlt die Verwendung von 100 µM ATP, die Purinergic Kalzium abhängigen Cl– -Sekretion, dienen als Positivkontrolle für den Test zu aktivieren; Dies ist jedoch eine optionale Test.

Representative Results

In normalen Atemwege Epithelien ist Na+ Absorption der primären Ion Transportaktivität. Dies führt zu einer negativen Atemwege Oberfläche Potenzialdifferenz im Hinblick auf die Interstitium. Perfusion der ENaC-Kanal Blocker Amilorid führt zu einer weniger negative Potentialdifferenz. Dann Superfusion cl–-freie Lösung schafft einen chemischen Gradienten für Cl-, die eine negativere Potentialdifferenz erstellt und aktiviert die Cl– -Transporter, einschließlich CFTR. Isoproterenol, die intrazellulären cAMP zunimmt, Cl– -Sekretion durch speziell Aktivierung CFTR erhöht und erhöht die Potentialdifferenz. Im Gegensatz dazu vermittelt bei CF-Patienten, abwesend oder dysfunktionalen CFTR führt zu einer erhöhten ENaC Na+ Absorption12. Infolgedessen ist die Grundlinie Potentialdifferenz mehr negativ. Die Depolarisation beobachtet mit Anwendung von Amilorid ist größer, während es minimal ist oder keine Änderung in der Potentialdifferenz nach Stimulation der Cl– -Sekretion durch CFTR-abhängige Signalwege. Dies ist in den repräsentativen Kurven in Abbildung 8zeigt “gesunden” Vs “CF” Tracings ersichtlich. Abbildung 8: Repräsentative Tracings “gesund” und das Thema mit vgl. PD: Potentialdifferenz, ΔAmiloride: Delta Amilorid, 0 Cl–/Iso–: niedrige Chlorid: die Veränderung der PD zwischen Abschluss der Lösung #2 und #4 Lösung Perfusion, S1-S4: Stufen 1-4, grüne Linie auf Graphen A und B zeigen die NPD Rückverfolgung und schwarz Pfeile zeigen den Unterschied in der Potentialdifferenz

Discussion

In Vivo, NPD bietet eine einmalige Messung, die wiederholt auf eine longitudinale Basis durchgeführt werden kann und zeigt, dass mit wiederholten Messungen längs ähnliche Ergebnisse auf eine unternehmensweite und individuelle Basis¹⁴^{eingehalten werden,} ¹⁵. Es gibt starke Hinweise, dass NPD hat ausgezeichnete Diskriminierung Gültigkeit von nicht-CF CF zu unterscheiden. 25 Studien zeigten durchweg ein statistisch signifikanter Unterschied in Cl^– und Na⁺ Leitwert zwischen CF-Patienten und gesunden Kontrollpersonen¹⁰. Während mehrere zuvor entwickelten Indizes dieser Fähigkeit unter Beweis stellen, erwarten wir, dass neue Updates notwendig angesichts der jüngsten Standardisierungen Methodik⁷^,^{8 sind}.

Modifikationen und Fehlerbehebung

Dieser Test erfordert mehrere wichtige Schritte um genaue Messungen zu gewährleisten. Dazu gehören den Elektroden und Kathetern closed-Loop-Offset um sicherzustellen, dass das System zur empfohlenen Standards ausgeführt wird. Patienten müssen bleiben und sprechen, wie dies minimiert die Artefakte und Katheter Entwurzelung zu unterlassen. Dies erschwert den Test bei nicht-kooperativen Patienten und die Technik wurde nur in einer Studie bei Kindern unter 6 Jahren des Alters⁷berichtet.

Pre-Inspection der nasalen Epithel ist notwendig, um sicherzustellen, dass es keine Krusten oder Schleim auf das Epithel, das Messungen beeinflussen können.

Sehr wichtig ist, ist darauf hinzuweisen, dass die Lage der Platzierung des Katheters Gegenstand der Debatte ist. Die hier vorgestellten SOP nutzt Messung unter der unteren Nasenmuschel (IT). Die Platzierung des Katheters unter der IT wurde standardisiert und in multizentrischen Studien durchgeführt und, deshalb, dies ist das empfohlene Verfahren. Unter der IT mit dem seitlichen Loch Katheter gemessen, die schwer zu pflegen sein kann in engen Kontakt mit der Nasenschleimhaut, während in Kontakt mit den Lösungen. Andere Gruppen können die PD nasale Erdgeschoss, Messen, die welche technisch einfacher ist. Wichtig ist, demonstriert Vermeulen (2011), dass die 2 Methoden vergleichbar¹⁶.

Die Erwärmung der Lösungen bleibt eine Angelegenheit der Debatte zwischen europäischen und US-Centers¹⁷^,¹⁸. Es hat dafür ausgesprochen worden, mit Lösungen bei 37 ° C anstelle von 22 ° C die beobachteten insgesamt Chlorid-Antwort erhöht von ca. 25 % und die β1-abhängigen Chlorid-Antwort von ca. 95 %¹⁸. Jedoch mit zunehmender Erwärmung Variabilität, durch eine größere Standardabweichung der gesamten Chlorid Antwort¹⁷bewertet. Also, da Erwärmung der Lösungen ein weiterer Faktor der Variabilität ist, ist es ratsam, nicht um die Lösungen zu wärmen, es sei denn, auf Basis einer Studie.

Wir haben zuvor sowohl der Elektrode Techniken verglichen und festgestellt, dass die AgCl und Kalomel Elektrodensysteme ebenso basale und stimulierte Ströme in gesunden Probanden¹³betrieben.

Grenzen der Technik

Diese Prüfung unterliegt erheblichen innerhalb Thema Variabilität. Die Variabilität des scoring ist vor allem bei Patienten mit unbestimmten Kurven und dies sollte in Diagnoseanwendung¹⁹berücksichtigt werden. Faktoren der Variabilität gehören akute obere Atemwege, umfangreiche Nasenpolypen, vorherige Nasennebenhöhlenchirurgie und CF-im Zusammenhang mit Entzündungen, die seine Spezifität und Sensitivität²⁰^,¹⁰zu verringern. Darüber hinaus möglicherweise Interpretation der Kurven unterschiedlich zwischen den Lesern, obwohl fachkundige Leser exzellenten Übereinstimmung des quantitativen scoring und Interpretierbarkeit in CF und nicht-CF Umzeichnungen, zeigen im Gegensatz zu einer erheblichen Variabilität in der Vertrauen der Ablaufverfolgung¹⁹.

Intrinsische Variabilität im Vergleich zu erheblichen Schwellenwerte

Sehr wichtig ist, die physiologische Variabilität der Messung ist beträchtlich, wie in verschiedenen Studien¹⁰, wie die CFTR-Gen-Therapie-Studien dargestellt, die erhebliche Variabilität in Änderungen in Chlorid Verkehr insgesamt gezeigt und Amilorid reichen²¹^,²². Cross-Sectional Bewertung legt nahe, dass NULL Cl^– plus Isoproterenol Antwort oberhalb der Schwelle von-5 bis-7 mV ist der Cut-off zwischen CF und nicht-CF Themen¹⁰.

Uns fehlt dennoch klare Erkenntnis über das Ausmaß der Veränderung dieses Parameters, eine effektive CFTR-Korrektur in Phase-II-Studien mit krankheitsmodifizierende Therapien darstellt. Um individuelle Reaktion zu beurteilen, gegebenenfalls wiederholte Prüfungen, Überwachung der Reaktion auf eine Intervention signifikante Veränderungen von intrinsischen Variabilität zu unterscheiden. Sehr wichtig ist, müssen zukünftige Langzeitstudien mit krankheitsmodifizierende Medikamente zeigen, dass die Verbesserung der CFTR-Funktion korreliert mit klinisch relevanter Ergebnisse oder Surrogat-Ergebnisse (z. B. Verbesserung der FEV₁) Verbesserung der CF Erkrankung. In der Tat, markiert eine neue Phase II Ivacaftor Studie zeigte klinischen Nutzen trotz einer kleinen Verbesserung der Chlorid-Sekretion²³.

Solche Studien helfen festzustellen, ob ein Grenzwert von Verbesserung der Trans-epithelialen Cl^–Leitwert ein Surrogatparameter für die klinischen Nutzen sein könnte. Dies wäre ein wichtiger Parameter zur Steuerung der Entwicklung von CFTR Therapien zu ändern.

Bedeutung im Hinblick auf bestehende Methoden: Schwitzen Test und Darm aktuelle Messungen (ICM)

Bei Patienten mit ” fragwürdige ” Mukoviszidose bewertet als eine fortgeschrittene Schweiße Cl^– -Konzentration zwischen 30 und 60 mM, NPD composite Scores zur Verfügung gestellt ein hochsensibler Werkzeug, um Patienten zu diagnostizieren, die als ” CF-wahrscheinlich ” und ” CF-unwahrscheinlich ”¹⁰. Darm Strommessung (ICM), wonach eine ex Vivo Messung der net cl^– Fluten über die rektale Epithel, ermöglicht auch Bestimmung der verbleibenden CFTR-Funktion mit einer hohen Empfindlichkeit weil CFTR in hohem Grade zum Ausdruck kommt Dieses Epithel.

Wenn man bedenkt Änderung des CFTR-Funktion von CFTR-Modulatoren, die Beziehung zwischen diesen verschiedenen CFTR-Biomarker Änderungen ist derzeit unklar. Obwohl die jüngsten Arbeiten auf der Grundlage bestimmt Ivacaftor, dass NPD und Schweiß-Test korrelierte⁴, es ist noch nicht geklärt ist eine Messung in den Atemwegen ein besserer Prädiktor der Atemwege Ergebnis als zum Beispiel, der Schweiß testen²⁴ ^, ²⁵ oder Änderung im ICM. Darüber hinaus können Modifizierer Drogen auch in deren Organ spezifischen Wirksamkeiten abweichen. In Bezug auf NPD ist es wichtig zu beachten, dass Änderungen in basalen PD und Amilorid Antwort Na⁺ Transport, express, während Änderungen in 0 Cl^– und Isoproterenol Antwort Cl^– Transport express. Es ist noch festzulegen, welche davon für die Besserung der Krankheit wichtiger ist.

Künftige Anwendung dieser Technik

Die Verwendung dieser Technik dürfte außerhalb des CF-Feldes. Da diese Technik einzigartig geeignet ist, um Na⁺ und Cl^– Ionenkanal, demonstrieren kann angewendet werden um Dysfunktion bei Erkrankungen der Atemwege einschließlich Asthma²⁶, chronische Bronchitis²⁷,-CF Bronchiektasen^{28 zu demonstrieren}und wiederholten bauchspeicheldrüsenentzündungen²⁹. Darüber hinaus wurden Änderungen dieser Technik in den unteren Atemwegen (LAPD) zur unteren Atemwege ausgerichtete CFTR-Dysfunktion bei chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) Patienten mit chronischer Bronchitis³⁰zeigen.

NPD stellt sensible in Vivo Biomarker des CFTR-Funktion, die für beide die Diagnose einsetzbar und auch für Proof-of-Concept-Studien mit dem Ziel, die richtige CFTR und ENaC Kanal Aktivität in der translationalen Forschung. Dadurch können längs Bewertung der Trans-epithelialen Funktion und hält Versprechen als eine Strategie für die personalisierte Medizin, die effizienteste Korrektor für jeden Patienten mit CF anzupassen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde von der Arbeitsgruppe für CFTR-Funktion des Ausschusses Standardisierung (Clinical Trials Network, Europäische Gesellschaft für Cystische Fibrose) und der nationalen Ressourcen Center Working Group (Therapeutika Development Network, Mukoviszidose unterstützt. Foundation). Ergänzend wurde von der CF-Stiftung (Clancy FY09 GV) und NIH (DK072482 SMR und GMS).

Materials

KD Scientific infusion pump (or equivalent – such as programmable infusion pumps provided by the institution/hospital)	Fisher Scientific
Powerlab 4/30	AD Instruments
BMA-200 AC/DC portable bioamplifier	AD Instruments
IS0-Z isolation headstage for BMA-200	AD Instruments
Windows compatible PC – Minimum requirements of Windows XP or higher	Various
AD Instruments software: GLP Client V6 (Windows) or higher	AD Instruments
ECG electrode (ground for study subject)	Hospital standard
2 mini calomel reference electrodes	Fisher Scientific	13-620-79
Potassium Chloride KCl, Granular – USP, formula weight 76, qty: 500 gm	Spectrum
Sterile container (such as specimen collection container , or similar) to be used for KCl calomel bath, with holes cut in lid to hold electrodes in place. (If not provided by electrode manufacturer.)	Hospital standard
2 electrodes: Ag/AgCl 8 mm TP electrode	BIOPAC Systems	UNSHLD-EL258
2 Ag/AgCl electrodes, B0194, plug 4 mm	SLE Instruments
Signacreme® Conductive Electrode Cream	Fisher Scientific	Parker Labs ref # 17-05
Skin abrasion device	PROMED Feeling	Ref 374901
Hi Di 541 M, Diamond tipped dental burrs	Ash Instruments
Becton Dickinson PE 50 tubing	Fisher Scientific	427411
Becton Dickinson PE 90 tubing	Fisher Scientific	427421
Silastic tubing, 0.062” ID, 0.095” OD	Fisher Scientific	508-007
Micropore Surgical Tape Paper (25 mm x 9.1 m)	3M	1530-1
Marquat double lumen catheter Length: 80 cm; Outer diameter: 2.5 mm; Internal diameter of the channels: 0.8 mm; Distance of the side-holes to the tip: 2 mm. EU label Agreement for NPD: I0202US	Marquat	I0202US
1" X 10 yards silk tape	3M Durapore	1538-1
IV extension tubing (30", 50/box)	International Limited	IMN30
Three-way stopcock (50/box)	Medex	MX5311L
Sterile syringe filters (ANOTOP 25 sterile 50pk; 0.22-micron or smaller filters; or equivalent)	Fisher Scientific	09-926-7
Becton Dickinson Intramedic Luer stub adapter (20G, for connection to PE90 if using nasal catheter produced at study site)	Fisher Scientific	427564
Becton Dickinson 23G, 0.75” Vacutainer (“butterfly”) needles (0.6 x 19 mm; 50U/box) (for connection to PE50) if using nasal catheter produced at study site)	Fisher Scientific	367283
Becton Dickinson Syringe 60 ml without needle Luer-Lok tip (40/Box)	Fisher Scientific	309653
Becton Dickinson Syringe 10 ml without needle Luer-Lok tip (100/Box	Fisher Scientific	309604
Single use sterile wipes (per institutional availability)	Hospital standard
70% EtOH (1 pint), Aaper Alcohol and Chemical Co. catalog number NC9274019 (or equivalent)	Fisher Scientific
Corning single use sterile bottle-top filters, 0.22 μm pore size (0.15 – 1.0 litre volumes acceptable)	Fisher Scientific	430624
Buffer Cert Ph 10.00 (1L Sn04332) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 4.00 (1L Sn04327) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Buffer Cert Ph 7.00 (500 ml Sn04328) – for pH meter calibration	Fisher Scientific
Disposable underpads (Blue Pads; 23"X36" 150/Box; or equivalent per hospital standard)	SureCare
23G, 0.75” Vacutainer “butterfly” needles (0.6×19 mm; 50U/box)	Becton Dickinson	367283
Difco Laboratories Agar (Noble 100g 0142-15-2; or equivalent)	Fisher Scientific
Welch Allyn Rhinoscope 71000-C (or equivalent)	Fisher Scientific
Welch Allyn Convertible Handle Battery 72300 (or equivalent) OR Otoscope with battery	Fisher Scientific
Head and chin rest (or equivalent; optional)	Richmond Products, Inc	629R
Static Dissipative Anti-Fatigue Matting (or equivalent)	Fisher Scientific	No. 791
REAGENTS FOR SOLUTIONS MIXED ON SITE
Sodium Chloride, Granular – USP NaCl	Spectrum		Formula Weight: 58; Size: 500 gm
Calcium Chloride CaCl2•2H2O – USP	Spectrum		Formula Weight: 147; Size: 500 gm
Magnesium Chloride Hexahydrate Crystal, MgCl2•6H2O – USP	Spectrum		Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Dibasic, Anhydrous, Granular, K2HPO4 – USP	Spectrum		Formula Weight: 174; Size: 500 gm
Potassium Phosphate Monobasic Crystals – NF (KH2PO4)	Spectrum		Formula Weight: 136; Size: 500 gm
Sodium Gluconate- USP (monosodium salt)	Spectrum		Formula Weight: 218; Size: 500 gm
Calcium Gluconate – USP (Anhydrous Powder)	Spectrum		Formula Weight: 430; Size: 500 gm
Potassium Gluconate- USP (Anhydrous)	Spectrum		Formula Weight: 234; Size: 500 gm
Magnesium Sulfate Heptahydrate – USP MgSO4•7H2O	Spectrum		Formula Weight: 246; Size: 500 gm
Amiloride HCl – USP	Spectrum		Formula Weight: 302; Size: 5gm
Adenosine 5’-Triphosphate (ATP) (Disodium salt)	Spectrum		Formula Weight: 551; Size: 5gm
Magnesium Chloride, Hexahydrate, Crystal – USP MgCl2•6H2O	Spectrum		Formula Weight: 203; Size: 500 gm
Double-distilled water (ddH2O)	Hospital Pharmacy		Formula Weight: NA; Size: 1 L
Isoproterenol HCL Injection – USP 1 mg/5 ml ampule	Hospital Pharmacy		Formula Weight: 248; Size: single use
Ringers Injection, USP or Ringers Irrigation	Hospital Pharmacy		Formula Weight: NA; Size: 5 L

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Citar este artículo

Solomon, G. M., Bronsveld, I., Hayes, K., Wilschanski, M., Melotti, P., Rowe, S. M., Sermet-Gaudelus, I. Standardized Measurement of Nasal Membrane Transepithelial Potential Difference (NPD). J. Vis. Exp. (139), e57006, doi:10.3791/57006 (2018).