Purificación de hepatocitos y células endoteliales sinusoidales del hígado de ratón de perfusión

Animales todos los procedimientos descritos en este protocolo han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Lincoln – Nebraska bajo protocolo #1435. 1. preparación Preparación de soluciones y medios de cultivo Preparar todos los medios de cultivo y buffer de acuerdo con la Tabla de materiales. Preparación de instrumentos Configurar un baño de agua (> 10 L) a 42 ° C, una bomba peristáltica con velocidad variable y las abrazaderas para sostener matraces. Preparar la curva tijeras y pinzas (figura 1). En o adyacente al baño de agua, instale una placa para horno (de 38 x 26 cm) con una almohadilla de espuma de poliestireno (rack cónico de 50 mL), con un Empapador absorbente cortar una pieza de 20 x 20 cm (figura 1). Coloque un pedazo de cinta adhesiva (5-8 cm) cerca. Colocar un hilo de coser de poliéster de 20 cm es cortado y listo para usar. Obtener un catéter plástico con una aguja retráctil (7 mm x 19 mm, figura 1). Preparación de la cristalería Con pinzas, colocar e inmovilizar un matraz de 1 L en el baño de agua con 200 mL de 1 x PBS con un tapón que tiene dos pipetas de 1 mL en la solución. El tapón de goma es dentado para permitir la recirculación del líquido en circuito cerrado. Con la otra abrazadera, coloque un frasco de 125 mL que contiene 45 mL de tampón 2 junto con un tapón que tiene dos pipetas de 1 mL, una de ellas es en el líquido cerca de la parte inferior de la cubeta y la otra que queda sobre el líquido y oxígeno se funde en el matraz.Nota: Cada pipeta en los topes tendrán una rápida desconecte el adaptador conectado al extremo para cambio fácil de la tubería. Oxígeno será fluir suavemente en ambos matraces a través de la pipeta en el tope que no se encuentra inmerso en el líquido. Dejar de lado dos placas estériles de cristalización. 2. animal procedimiento Calentar las soluciones de PBS y tampón de 2 a 42 ° C en el baño de agua y circular PBS para por lo menos 20 mL/min en la tubería en circuito cerrado para mantener las líneas de líquido caliente. Sumergir cualquier exceso de tubo en el baño de agua permanezca lo más cerca posible a 42 ° C. El extremo macho del tubo en PBS que contenga 1 L frasco de drenaje. Coloque una bola de algodón en el Empapador absorbente y añadir unos 2 mL de 30% de isoflurano (compuesto de polietilenglicol 200 que disminuye la tasa de evaporación de isoflurano) en la bola de algodón con una pipeta de transferencia. Recoger el ratón por la cola, colocar en uno de los platos la cristalización y luego rápidamente volcar el plato sobre la bola de algodón para que el ratón tiene un pequeño espacio en el que se inhala la anestesia. Observar el ritmo respiratorio del ratón y asegúrese que el ratón está efectivamente bajo anestesia.Nota: El ritmo respiratorio debe ser más lento y más profundo, la cola flácida y las patas no responden a la prueba del pellizco bajo anestesia; Consulte las pautas IACUC para detalles adicionales. Mientras que el ratón va con anestesia (esto tarda 1-2 min), preparar el barril de la jeringa de 10 mL saque el émbolo e insertando una bola de algodón. Añadir 1-2 mL de 30% isoflurano con una pipeta a la bola de algodón dentro del barril y coloque el cañón boca abajo sobre una mesa mientras espera para que el ratón quede inconsciente. Rápidamente quitar el plato de la cristalización, voltear el ratón en su parte posterior y coloque el cuerpo de la jeringuilla sobre su nariz. Comprobar el ritmo respiratorio, pellizco del dedo del pie y cola fláccida. Las respuestas a la pizca del dedo del pie y la cola flácida indica que el ratón no está completamente bajo anestesia. Mantener el cuerpo de la jeringuilla sobre el hocico para mantener la inconsciencia. Chinchetas de lugar a través de las patas del ratón, con las extremidades extendidas en posición supina. Moje el abdomen y caja torácica con 70% isopropanol o etanol. Con el fórceps recto en una mano, levantar la piel cerca de la base del abdomen. Con las tijeras en la otra mano, corte el entoldado de la piel y el peritoneo. La incisión debe ser horizontal o en toda la base de la piel tiendas de campaña. Asegúrese de cortar a través de todas las capas de la piel y el peritoneo para acceder a la tripa. Cortar lateralmente alrededor del abdomen hasta las costillas en ambos lados sin mellar a cualquiera de los órganos. Cortar el colgajo de piel por corte a través de la caja torácica inferior. Mover los intestinos hacia la derecha con la parte posterior de las pinzas para exponer la vena porta.Nota: La sangría del animal debe ser mínima; el animal todavía debe respirar y bajo anestesia profunda. Coloque las pinzas curvas cerradas debajo de la vena porta entre el hígado y vena pancreaticoduodenal superior (flecha de lafigura 3 ). Abrir la pinza por debajo de la vena porta. Sujete el hilo y tire cuidadosamente a través de modo que quede centrado debajo de la vena porta. Ate un nudo alrededor de la vena porta sin con cincha lo abajo. Coloque las pinzas curvas debajo de la vena porta y tire suavemente hacia la cola del ratón para enderezar la vena (figura 4A). Con el catéter en la otra mano, colocar el bisel de la aguja hacia arriba y paralela a la parte inferior de la vena porta junto a las pinzas (figura 4B). Pinchar ligeramente la vena con la aguja (figura 4C). Asegúrese de que el bisel de la aguja está en el lumen de la vena. Retraer la aguja accionada por resorte y seguir empujando el catéter del polímero a través de la vena hasta que el bisel es cerca de la zona de ramas venosa. Esto es dentro del hígado. Si el catéter está colocado correctamente, será visible un reflujo de sangre. (Figura 4D). Apriete el nudo y tire hacia abajo del catéter para ayudar a estabilizarlo. Inmediatamente bajar la velocidad de la bomba de 20 mL/min a 4 mL/min y corte otro vaso sanguíneo principales de drenaje. Cortar la aorta abdominalis para obtener resultados óptimos. Coloque el extremo macho del tubo hasta el final femenino del catéter (figura 5A). Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire en la línea. Tenga cuidado de que el catéter no está tampoco empujó en el hígado o fuera de la vena. Colocación de la rosca no es esencial, pero ayuda a prevenir el reflujo de la vena y ayuda a mantener el catéter en la posición correcta (figura 5B, C). Utilice cinta adhesiva para inmovilizar la tubería en el Empapador. Utilizar el fórceps recto para apretar el vaso sanguíneo efluentes para hinchar el hígado un par de veces para asegurar que toda la sangre se drena(figura 5).Nota: Cinta de laboratorio estándar no funcionen; sin embargo, cinta de enmascarar permanecerá pegada al Empapador, incluso en condiciones húmedas. 3. hígada perfusión Mientras que el hígado es lavado con PBS, mida alrededor de 24 mg de colagenasa tipo IV y coloque en el matraz que contiene 45 mL de tampón 2 en el baño de agua. Asegúrese de agitar el líquido en el matraz para que la colagenasa se haya disuelto completamente y volver a colocar el frasco en la abrazadera para que la porción que contiene líquida del matraz esté completamente sumergida en el agua. Observe el cambio de color del hígado mientras que se lava con PBS. Cambiar el tubo de salida del frasco de 1 L en el matraz de 125 mL. No permita que las burbujas de aire en el hígado. Una vez que el buffer de perfusión alcanza el hígado, brevemente apriete firmemente el vaso sanguíneo efluentes para acumular presión en el recipiente y permita que este líquido llenar todos los lóbulos del hígado. Asegúrese de no cortar el drenaje demasiado, ya puede reventar el fina del tejido conectivo que rodea el hígado (cápsula de Glisson) y destruir la perfusión o el flujo del líquido dentro del lecho capilar del hígado. Permite 2 Buffer con colagenasa para perfusión a través del hígado, hasta 45 mL todos han fluido a través del tejido.Nota: Si tiene éxito, la cápsula de Glisson debe ser separada de la parenquimia o el tejido del hígado y el hígado se debe aparecer amorfo. Añadir aproximadamente 10 mL de tampón 1 a otro plato la cristalización y colóquelo junto al ratón. Retirar el catéter y apagar la bomba. Con la recta pinzas y tijeras, cortar el hígado de ratón. Si la digestión de colagenasa era muy eficiente, puede ser necesario contar con una cuchara limpia y estéril en la mano para sacar el hígado de ratón y colocar en el búfer de 1. 4. hepatocitos purificación Nota: Manipulación de las células se realiza en una campana de cultivo estériles para tejidos para limitar la contaminación si las células son cultivadas en todas las etapas posteriores. Utilizando una técnica estéril, agarrar el hígado con pinzas y agítelo suavemente las células del hígado. Destrozar o tire hacia atrás la cápsula de Glisson: el buffer se volverá opaco como se agitan las células del hígado. Retirar la solución de la célula en un cónico de 50 mL con 100 μm filtro colocado sobre la parte superior. Añadir más 1 Buffer a los restos de hígado y continúan sacudiendo las células. Continúe hasta que el hígado aparece desprovisto de células o cuando las porciones no digeridas del hígado no producen más células. Vierta el líquido celular en otro 50 mL cónico que contiene un filtro μm 40. De centrífuga cónico en un rotor de cubo que hace pivotar a 100 x g durante 3 minutos.Nota: No use el freno máximo como esto puede desalojar el precipitado de células. Utilice el freno en el 80% que es suficiente para todos los restantes pasos de centrifugación a 4 ° C Retirar el sobrenadante (que contiene NPCs y hepatocitos muertos) en un limpio cónico y coloque en hielo. Asegúrese de que esto se hace en un solo movimiento para observar cumplimiento de pellets. Resuspender el pellet en 40 mL de Buffer 1. Repita los pasos del 4.5 y 4.6. Resuspender el pellet en 40 mL de tampón de 3. Repita los pasos del 4.5 y 4.6 dos veces. Resuspender los hepatocitos purificados en caliente DMEM + 10% FBS + 2 x penicilina-estreptomicina (Pen/Strep). Si las células se cultivan en placas de colágeno recubierta, que puedan adherirse por 1 h y reemplazar los medios de comunicación por lo menos una vez ya que esto evitará que cualquier contaminante bacteriano naciente. Hacer las placas de colágeno recubierta por incubación con colágeno de 0,05% en ácido acético al 0.001% durante al menos 1 h a 37 ° C y luego lavado con PBS 1 x. Si la viabilidad del hepatocito es baja y existe un deseo de obtener hepatocitos viables alta purificados a continuación, utilizar el siguiente protocolo adaptado de Kreamer et al10. Mix 9 volúmenes de solución PVP (Percoll, una 23% w/w solución de agua y partículas de sílice coloidal 15-30 nm recubiertas de polivinilpirrolidona para la centrifugación de densidad) y el 1 volumen de 10 x HBSS para hacer una solución iso-osmótica de PVP (SIP). Añadir 24 mL de SIP a una estéril 50 mL cónico que pueden almacenarse en estas condiciones hasta por 2 meses a 4 ° C. Ajustar la concentración del hepatocito a 5-10 × 106 células/mL con medio de cultivo como el mencionado en el paso 4.8. Añadir 25 mL de la suspensión celular a cada mL 24 SIP con cónico y mezclar por inversión suave. La densidad de esta solución es de 1,06 g/mL. De centrífuga cónico 50 x g por 10 min a 4 ° C. Aspire el SIP y el floculante y resuspender las células en HBSS. Lavar las células por centrifugación a 50 x g por 10 min a 4 ° C. Repita el paso 4.10.6 una vez más y luego resuspender las células en un medio. 5. SEC purificación Sedimenten las células en los sobrenadantes de paso 4.6 girando los tubos a 163 x g durante 10 min, descartar el sobrenadante de los tubos y todos los pellets de células resuspender en 5 mL de RPMI sin suero y los piscina juntos en un tubo. Una vez que se agruparon todos pellets añadir RPMI a volumen final de 35 mL. El agrupado de centrífuga cónico a 25 x g por 3 minutos cuidadosamente aspirar el superior 25 mL de RPMI con una pipeta de 25 mL y lugar este medio con NPCs en un limpio 50 mL cónico en el hielo. Añadir 25 mL de RPMI fresco hacia el tubo y resuspender el precipitado. Repita el paso 5.3 para un segundo lavado y piscina el sobrenadante. Deseche los 10 mL restantes de pellet (el sedimento consiste principalmente en hepatocitos muertos) y los medios de comunicación. Centrifugar el sobrenadante agrupado a 163 x g por 10 min. Durante la centrifugación, preparar los gradientes de la solución PVP en un cónico de 50 mL. Añadir 15 mL de solución PVP de 50% a los 50 mL cónico seguido por 20 mL de Percoll overlaid con una pipeta a la velocidad de eyección más lenta el 25%. Asegúrese de observar una línea de refracción en la marca de 15 mL que delimita las dos capas, ya que es donde los segundos y KCs se agregan después de la centrifugación. Resuspender las células previamente peleteadas en paso 5.5 en 10 mL de RPMI frío y superposición en el gradiente de solución PVP. Asegúrese de mantener una clara demarcación entre las dos capas. Centrifugue el gradiente a 805 x g por 20 min con un freno de 50%. Aspirar de arriba hacia abajo dirección a la marca de 20 mL en el tubo y desechar este material. Con una pipeta de 5 mL, recoge las SECs y KCs que se encuentran en la interfaz de 25/50%. Deseche cualquier marrón grupos de células que son hepatocitos muertos. Colocar las células en un 50 mL cónico y añadir RPMI hasta la marca de 50 mL para diluir la solución de PVP. Centrifugue a 200 x g durante 10 min, con freno de 80%. Aspirar y descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado mientras se lava apagado el cono del cónico de 12 mL de RPMI caliente. Separar los segundos KCs por colocar el sobrenadante en una caja de Petri de poliestireno e incubar en una incubadora de cultivo de tejido humedecido durante 8 min a temperatura ambiente. Aspire los medios con una pipeta de 25 mL y enjuagar el plato con los mismos medios, con la pipeta ajustada en la velocidad más baja para recoger los restantes segundos mientras las KCs se adhieren a la placa. Centrifugue la seg a 200 x g durante 10 min y resuspender en RPMI + 5% FBS + pluma/Strep. Título de entonces las células y el lugar en platos de cultura recubiertas de colágeno.