Embriyonik hematopoetik kök hücre öncüleri endotel hücre niş ortak kültürü ile kombine sıralama tek hücre dizini kullanarak klonal analizi
Summary
Burada fare embriyonik gelişim sırasında hematopoetik kök hücre öncüleri klonal analizi için metodoloji mevcut. Endotel hücre ortak kültür ve fenotipik özellikleri ve tek hematopoetik öncüleri potansiyelini engraftment karakterize nakli ile embriyonik aort-erbezi-mesonephros bölgesinden tek hücre dizin sıralama birleştirin.
Abstract
Hematopoetik kök hücre (HSC) genesis embriyonik gelişim sırasında çalışma özelliği erken embriyo HSC öncüleri nadir ve işlevsel olarak uzun vadeli multilineage engraftment potansiyelini belirlemek deneyleri eksikliği ile sınırlı bireysel sözde HSC öncüleri. Burada, yalıtım ve işlevsel olarak doğrulanmış HSC öncüleri tek hücre düzeyinde karakterizasyonu sağlar metodoloji açıklayın. İlk olarak, biz kesin fenotipik parametresi, tek tek sıralanmış her hücrenin katalog için dizin sıralama kullanmak deneysel analizi için ek işaretçileri olan HSC öncüleri için zenginleştirmek için fenotipik işaretçileri kullanarak. İkinci olarak, her dizin sıralanır hücre vasküler niş stroma sigara engrafting HSC öncüleri multilineage, uzun vadeli engraftment içinde potansiyel ile fonksiyonel HSC için olgunlaşma destekler aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölge ile ortak kültürlü. nakli deneyleri. Bu metodoloji korelasyon klonal hemogenic öncüleri ile fonksiyonel engraftment potansiyellerini fenotipik özellikleri veya transkripsiyon profil, HSC habercisi ayrıntılı bir analiz için bir araç sağlayan gibi diğer özellikleri sağlar tek hücre düzeyinde geliştirme.
Introduction
Klonal çalışmalar heterojenite yetişkin HSCs, yaşlanma1sırasında HSC alt türlerini ve HSC davranış değişiklikleri yeni bilgi sağlayan uzun vadeli engraftment özelliklerini ortaya koymuştur. Ancak, embriyonik HSCs benzer çalışmaları ve onların öncüleri daha zor olmuştur. Erken embriyonik gelişim sırasında geçici bir süreç içinde hemogenic endotel anılacaktır olarak bilinen öncüleri nüfusu HSCs kaynaklanan olarak endotel hematopoetik geçiş2. Sağlam, uzun vadeli multilineage engraftment şartına yetişkin alıcılar nakli takip sağlamak için onların yetenek tarafından tanımlanan ilk HSC değil embriyonik günün ardından kadar 10.5 (E10.5) fare embriyo çok düşük frekanslı3, tespit . Gelişimleri sırasında öncüleri hemogenic endotel doğan HSC (pre-HSC) için olgunlaşma nakli deneyleri4,5 verimli engraftment için izin yetişkin HSC özelliklerini edinme önce geçmeleri gerekir , 6. nadir HSC kökenli, hematopoetik ataları ile erythroid, çok sayıda çalışmanın engellemeyecek myeloid ve lenfoid potansiyeli zaten algılanır HSC ortaya çıkması pre-HSC7,8önce. Böylece, pre-HSC diğer hematopoetik ataları ayırt clonally hücreleri izole etmek ve onları kendi olgunlaşma için yeterli sinyallerle HSC nakli deneyleri engraftment özelliklerini tespit etmek, sağlamak için yöntemler gerektirir.
Yaklaşımlar bir dizi tarafından ex vivo veya vivo olgunlaşma HSC için pre-HSC tespiti için izin olan tarif edilmiştir. Ex vivo yöntemler kültür nerede ilk HSC geliştirme9‘ tespit AGM bölge gibi embriyonik dokuların bağlıydı. Bu yöntemler, ayrılma, dahil protokolleri bina sıralama ve AGM dokuların yeniden toplama sıralanmış nüfus içinde para aort E11.5 için E9.5 üzerinden geliştirme sırasında HSC öncüleri içeren karakterizasyonu izin splanchnopleura (P-Sp) / AGM bölgeleri4,5,10; Ancak, bu yaklaşımların öncüleri klonal analiz için gerekli tek hücre düzeyinde yüksek üretilen iş analizi için mükellef değildir. Microenvironment HSC öncüleri, daha önceki aşamalarında destek için daha uygun olduğu kabul edilir nerede benzer şekilde, in vivo olgunlaşma yeni doğmuş fare, içine nakli tarafından da sarısı sac ve AGM sıralanmış nüfus çalışmaları sağladı / P-Sp (P-Sp habercisi AGM için bölgedir) pre-HSC, ama bu yöntemleri özellikleri ile de tek için sağlam bir platform sağlamak için başarısız hücre analizi11,12.
Rafii ve ark. çalışmalardan o Akt aktive endotel hücre (EC) stroma bir niş substrat yetişkin HSC kendini yenileme vitro13,14,15desteği sağlayabilir gösterdi. Biz son zamanlarda Akt aktif EC AGM bölgesinden (AGM-EC) elde edilen hemogenic öncüleri, gibi erken E9 geliştirme, HSC, Yetişkin engrafting için hem de sonraki izole olgunlaşma için uygun vitro niş sağlar tespit kendini yenileme oluşturulan HSC16. Bu sistemi basit bir 2-boyutlu ortak kültür istihdam olduğunu göz önüne alındığında, tek tek izole hemogenic öncüleri HSC potansiyelini klonal analiz için kolayca uyarlanabilir.
Son zamanlarda bir yaklaşım bireysel hemogenic öncüleri AGM-AB ortak kültür ve sonraki fonksiyonel analiz Ekiminde fare embriyo gelen dizin sıralanması birleştirerek klonal hemogenic öncüleri HSC potansiyelini tahlil bildirdin 17deneyleri. Dizin sıralama olduğunu Floresans aktif bir mod hücre (FACS) bu kayıtları (dizinler) sıralama her tek tek sıralanmış hücre böyle fenotipik parametreleri (Yani, ileri dağılım (FSC-A), yan dağılım (SSC-A), floresan parametreleri) tüm bu özellikleri geriye dönük olarak sıralama takip sonraki fonksiyonel analiz için ilişkili olabilir. FACS yazılım her hücre ve pozisyonu/kuyunun yerleştirildiği 96-şey plaka için her iki fenotipik bilgileri kaydeder. Bu teknik daha önce zarif kullanılmış olan yetişkin HSC heterojenite tanımlamak, daha fazla HSC uzun vadeli engrafting alt için zenginleştirmek ve fenotipik HSC parametrelerinin transkripsiyon ile aralarındaki ilişkileri belirlemektir fenotipik parametreleri belirlemek için özellikleri tek düzey18,19hücre. Burada, benzersiz fenotipik parametreleri tanımlaması ve pre-HSC katkılarıyla lineage embriyonik gelişme erken aşamalarında sağlar bu yaklaşımın detaylı metodoloji sağlamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
HSC genesis embriyonik gelişim sırasında çalışmanın HSC potansiyel henüz transplante yetişkin alıcılar uzun vadeli multilineage hematopoetik rekonstitüsyon sağlamak için yetki eksik hemogenic öncüleri olarak algılamak için araç gerektirir. Bu protokol için biz embriyonik hemogenic öncüleri klonal bir tahlil vasküler niş ECs stromal ortak kültür tarafından öncüleri HSC için olgunlaşma destekler, AGM fonksiyonel analizde sonraki nakli deneyleri ile mevcut. Dizin izinleri sıralama birleşmesi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fred Hutchinson Akış Sitometresi temel yardım için FACS ile Andrew Berger, Stacey Dozono ve Brian Raden teşekkür etmek istiyorum. Bu eser yardımcı işbirlikçi Grant #HL099997 ve NIDDK #RC2DK114777 vermek #HL100395, ulusal kurumları sağlık NHLBI UO1 grant tarafından desteklenmiştir. Brandon Hadland Alex’in limonata standı Vakfı ve Hyundai umut üzerinde tekerlekler Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| AGM-EC culture media | |||
| Materials for culture of endothelial cells | |||
| TrypLE Express | Gibco | 12605-028 | Use to dissociate AGM-EC monolayers |
| Gelatin 0.1% in water | StemCell Technologies | 7903 | Use to adhere AGM-EC monolayers to plastic |
| 96-well tissue culture plates | Corning | 3599 | Use to co-culture AGM-EC monolayers and index sorted clones |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Use for dissection and FACS staining |
| 500 ml filter bottles | Fisher Scientific | 9741202 | Use to sterile filter Endothelial media |
| AGM-EC culture media (500 mls) | |||
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | 12440-053 | 400 mls |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH30088.03 | 100 mls |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 5 mls |
| Heparin | Sigma | H3149 | 50 mg dissolved in 10 mls media |
| L-glutamine (200 mM) | StemCell Technologies | 7100 | 5 mls |
| Endothelial Mitogen (ECGS) | Alfa Aesar | J64516 (BT-203) | Add 10 mls media to dissolve and add |
| Materials for AGM index sort | |||
| Collagenase (0.25%) | StemCell Technologies | 7902 | Use for dissociation of embryonic tissues |
| 3ml syringe | BD Biosciences | 309657 | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 0.22 µM syringe-driven filter | Millipore | SLGP033RS | Use to sterile filter antibody solutions for FACS |
| 5 ml polystyrene tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | Use to remove cell clumps prior to FACS |
| DAPI (prepared as 1 mg/ml stock in H2O) | Millipore | 268298 | Use to exclude dead cells from sort |
| anti-mouse CD16/CD32 (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | Use to block non-specific staining to Fc receptors |
| Antibodies for AGM index sort | |||
| Anti-mouse CD144 PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-1441-82 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4301-81 | Isotype control for CD144 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710 | eBioscience | 46-2012-80 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP-eFlour710 | eBioscience | 46-4031-80 | Isotype control for CD201 PerCP-eFluor710 |
| Anti-mouse CD41 PE | BD Biosciences | 558040 | Staining |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control, PE | BD Biosciences | 553925 | Isotype control for CD41 PE |
| Anti-mouse CD45 FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4031-81 | Isotype control for CD45 FITC |
| AGM-serum free media (10mls) | |||
| X-Vivo 20 | Lonza | 04-448Q | 10 mls |
| recombinant murine stem cell factor (SCF) | Peprotech | 250-03 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human FLT3 Ligand (FLT3L) | Peprotech | 300-19 | 10 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 100 ng/ml |
| recombinant human thrombopoietin (TPO) | Peprotech | 300-18 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| recombinant murine interleukin-3 (IL3) | Peprotech | 213-13 | 2 ml (100 mg/ml stock) Final concentration 20 ng/ml |
| Materials for Staining co-cultured cells | |||
| 96 well plate, V-bottom | Corning | 3894 | Use for FACS analysis |
| Antibodies for analysis of Index sorted clones co-cultured with endothelial cells | |||
| Anti-mouse CD45 PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience | 45-0451-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE-Cyanine5.5 | eBioscience | 35-4031-80 | Isotype control for CD45 PerCP-Cyanine5.5 |
| Anti-mouse CD201 (EPCR) PE | eBioscience | 12-2012-82 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4031-81 | Isotype control for CD201 PE |
| Anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) APC | eBioscience | 17-5981-83 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | eBioscience | 17-4321-81 | Isotype control for Ly-6A/E APC |
| Anti-mouse F4/80 FITC | eBioscience | 11-4801-81 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, FITC | eBioscience | 11-4321-41 | Isotype control for F4/80 FITC |
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) FITC | BD Biosciences | 553127 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, FITC | BD Biosciences | 556923 | Isotype control for Ly-6G/C and CD3 FITC |
| Materials for tail vein injection for transplant | |||
| 1/2 ml insulin syringes with 29G 1/2" needles | BD Biosciences | 309306 | Use for tail vein injection for transplantation |
| Antibodies for Peripheral Blood analysis following translant | |||
| Anti-mouse Ly-6G/C (Gr1) PerCP | Biolegend | 108426 | Staining |
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PerCP | Biolegend | 400629 | Isotype control for Ly-6G/C PerCP |
| Anti-mouse F4/80 PE | eBioscience | 12-4801-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE | eBioscience | 12-4321-80 | Isotype control for F4/80 PE |
| Anti-mouse CD3 FITC | BD Biosciences | 555274 | Staining |
| Anti-mouse CD19 APC | BD Biosciences | 550992 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC | BD Biosciences | 553932 | Isotype control for CD19 APC |
| Anti-mouse CD45.1 (A20) PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-0453-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4321-81 | Isotype control for CD45.1 PE-Cyanine7 |
| Anti-mouse CD45.2 (104) APC-eFluor780 | eBioscience | 47-0454-82 | Staining |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control, APC-eFluor780 | eBioscience | 47-4321-80 | Isotype control for CD45.2 APC-eFluor780 |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II with DIVA software | BD Biosciences | ||
| BD FACSCanto II with plate reader | BD Biosciences | ||
| Haemocytometer | Fisher Scientific | S17040 | For counting cells |
| Multi-channel pipette | Fisher Scientific | 14-559-417 | For dispensing cells |
| FACS analysis software | FlowJo/BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
Referencias
- Copley, M. R., Beer, P. A., Eaves, C. J. Hematopoietic stem cell heterogeneity takes center stage. Cell Stem Cell. 10 (6), 690-697 (2012).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells/long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129 (21), 4891-4899 (2002).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208 (6), 1305-1315 (2011).
- Rybtsov, S., et al. Tracing the origin of the HSC hierarchy reveals an SCF-dependent, IL-3-independent CD43(-) embryonic precursor. Stem Cell Reports. 3 (3), 489-501 (2014).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Lin, Y., Yoder, M. C., Yoshimoto, M. Lymphoid progenitor emergence in the murine embryo and yolk sac precedes stem cell detection. Stem Cells Dev. 23 (11), 1168-1177 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Yoder, M. C., Hiatt, K., Mukherjee, P. In vivo repopulating hematopoietic stem cells are present in the murine yolk sac at day 9.0 postcoitus. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6776-6780 (1997).
- Arora, N., et al. Effect of developmental stage of HSC and recipient on transplant outcomes. Dev Cell. 29 (5), 621-628 (2014).
- Butler, J. M., Rafii, S. Generation of a vascular niche for studying stem cell homeostasis. Methods Mol Biol. 904, 221-233 (2012).
- Butler, J. M., et al. Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 6 (3), 251-264 (2010).
- Kobayashi, H., et al. Angiocrine factors from Akt-activated endothelial cells balance self-renewal and differentiation of haematopoietic stem cells. Nat Cell Biol. 12 (11), 1046-1056 (2010).
- Hadland, B. K., et al. Endothelium and NOTCH specify and amplify aorta-gonad-mesonephros-derived hematopoietic stem cells. J Clin Invest. 125 (5), 2032-2045 (2015).
- Hadland, B. K., et al. A Common Origin for B-1a and B-2 Lymphocytes in Clonal Pre- Hematopoietic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (6), 1563-1572 (2017).
- Wilson, N. K., et al. Combined Single-Cell Functional and Gene Expression Analysis Resolves Heterogeneity within Stem Cell Populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Exp Hematol. 43 (9), 803-811 (2015).
- Morgan, K., Kharas, M., Dzierzak, E., Gilliland, D. G. Isolation of early hematopoietic stem cells from murine yolk sac and AGM. J Vis Exp. (16), (2008).
- deBruijn, M. F., et al. Hematopoietic stem cells localize to the endothelial cell layer in the midgestation mouse aorta. Immunity. 16 (5), 673-683 (2002).
- Lorsbach, R. B., et al. Role of RUNX1 in adult hematopoiesis: analysis of RUNX1-IRES-GFP knock-in mice reveals differential lineage expression. Blood. 103 (7), 2522-2529 (2004).
- Holmes, R., Zúñiga-Pflücker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), pdb.prot5156 (2009).
- Yoshimoto, M. The first wave of B lymphopoiesis develops independently of stem cells in the murine embryo. Ann N Y Acad Sci. 1362, 16-22 (2015).
- Kobayashi, M., et al. Functional B-1 progenitor cells are present in the hematopoietic stem cell-deficient embryo and depend on Cbfβ for their development. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12151-12156 (2014).
- Yoshimoto, M., et al. Autonomous murine T-cell progenitor production in the extra-embryonic yolk sac before HSC emergence. Blood. 119 (24), 5706-5714 (2012).
- Inlay, M. A., et al. Identification of multipotent progenitors that emerge prior to hematopoietic stem cells in embryonic development. Stem Cell Reports. 2 (4), 457-472 (2014).
- Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Lett. 590 (22), 3965-3974 (2016).
