Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme
Summary
Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.
Abstract
Süper çözümleme mikroskobu teknikleri giderek artan sayıda Nano hücresel dünya yöneten mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardımcı oluyor. Canlı hücreler içinde bireysel moleküllerin görselleştirme olağanüstü erişim sağlar gibi tek molekül görüntüleme ivme kazanıyor. Burada, tek-parçacık izleme fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (sptPALM) Drosophila larva gerçekleştirmek için geliştirdiğimiz bir tekniğini tanımlamak. Sinaptik iletişim kullanır bağlantı istasyonu, astar ve nörotransmitter içeren füzyon teşvik hareket anahtar presynaptic proteinler veziküller ile plazma zarı. Presynaptic proteinler bu nedenle bu önemli olaylar ile ilişkili hareket değişiklikleri sergi ve a sıra-in protein-protein ve protein-lipid etkileşimleri sıkıca bu işlemleri düzenler. Nasıl bu proteinler hareketliliğini sağlam bir canlı hayvan fizyolojik işlevleri ile ilişkili olan soruşturma kesin onların etki mekanizmaları anlamak için gerekli. Protein hareketlilik ile yüksek çözünürlüklü vivo içinde açılan optik şeffaflık, erişilebilirlik ve penetrasyon derinliği gibi sınırlamalar üstesinden gerektirir. Biz nasıl photoconvertible floresan proteinler ile hafif eğik aydınlatma görüntülenir ve motor sinir terminalinde veya üçüncü motor nöron akson boyunca izlenen sözdiziminin-1A presynaptic protein öğesini Drosophila biçim tarif larva.
Introduction
Nöronal iletişim nörotransmitter içeren sinaptik veziküller plazma zarı1ile düzenlenmiş füzyon yoluyla oluşur nörotransmitter yayın kullanır. Ekzositozu2,3,4,5,6 adı verilen bu işlem son derece dinamik ve yukarı – veya aşağı-düzenlenmiş göre stimülasyon7oranı dalgalanmalar olabilir. Bu süreçlerle ilgili proteinler Albert hareket tabi vardır ve bu nedenle Ortaölçek organizasyon bu fizyolojik fonksiyonları temelini oluşturan eylemleri bağlama bir dizi sürdürülmesi yetenekli görüntüleyin. Plazma membran proteinlerinin plazma zarı7,8,9,10,11nanoclusters içine moleküllerin yanal yakalama sağlayan son derece dinamik, 12. Bu nedenle, bu proteinler hareketliliğini soruşturma eylem8onların modu aydınlatmak için yardımcı olur. Sinaptik proteinler çözünür N-ethylmaleimide hassas faktör ek protein reseptörü (tuzaklarına), örneğin sözdiziminin-1A, gibi şimdi yanı sıra yanal hızlı hareketlilik sergi lateral görüntü bindirme olarak moleküler sunabilir nanoclusters içinde olduğu bilinmektedir depoları ve siteleri vezikül füzyon9,13,14,15.
Monomeric (m) Eos16,17 ve Kaede18, gibi photoconvertible floresan proteinlerin son gelişmeler böyle nöronal plazma membran proteinlerinin yaklaşımlar kullanarak Ortaölçek çözünürlüğe sağladı Fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)14,15,19. Bu gelişmeler hareketlilik ve nanoclustering kültürlü canlı hücreleri ve nöronlar biyolojik proteinlerin soruşturmalar etkinleştirdiniz. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar (benzer yüksek çözünürlüklerde) dinamiği ve canlı olduğu gibi organizmalar nöronlar içinde bu membran proteinlerinin organizasyonu böyle Mus musculus, Caenorhabditis elegans ve aydınlatmak için gerçekleştirilen Drosophila melanogaster14,20,21,22.
Araştırma dynamics ve protein vivo içinde organizasyonu sadece (örneğin fluorophores) PALM, fırtına ve photoconvertible, son zamanlarda geliştirilen süper çözünürlük görüntüleme araçlarının kullanımı bu tür engelleri aşmak için de alması gereken Erişilebilirlik protein ve düşsel lazer penetrasyon derinliği. Sağlam bir hayvan hücre içi proteinlerin Imaging proteinler sağlam hayvan, sağlam bir farenin Hipokampus gibi dokuların yaşam içinde derin gömülü yapıları üzerinde görüntüleme doğal olarak meydan okuyor. Bu nedenle, proteinler veya doku yüzeyine yakın daha kolay görüntüsü. Vivo Imaging ile başka bir zorluk hayvanlar arasında tekrarlanabilirlik sağlamada olduğunu. Anatomi bir örnekten diğerine farklı olabilir gibi farklı olduğu gibi hayvan örnekleri çoğaltması kolaylığı ile bir yapı seçerek de zorlu kanıtlamak. Basmakalıp yapıların kullanımını gibi synapses, bazı bu zorlukların üstesinden ile yardımcı.
Diğer araştırmalar yüzeyi protein organizasyonu bir doku/organ, örneğin yansıma iken son yıllarda yapılan çalışmalarda protein hareketlilik Caenorhabditis elegans22gibi optik şeffaf bir epidermis ile hayvanlarda görüntüsü bir canlı fare21kafatası ile kortikal nöronlar aktin görüntüleme. Bazı durumlarda, anestezikler hayvan hareketsiz tutmak için kullanılmıştır; Ancak, belirli anestezikler faiz protein olumsuz etkileyebilir. Hayvanlar vivo içinde görüntüleme sırasında hareketsiz tutmak için alternatif yolları bu nedenle hata en aza indirmek için keşfedilmeyi.
Süper çözünürlük görüntüleme vivo içinde için başka bir uyarı faiz proteinlerin aydınlatmak için kullanılan lazerler çevreleyen doku olumsuz etkileyebilecek ve bu nedenle uyarma yoğunluk mümkün olduğunca düşük tutmak tavsiye edilir. Aydınlatma lazer tarafından çevreleyen doku aynı zamanda arka plan sinyal artırmak eğilimindedir. Düşük uyarma yoğunluğu kullanımı arka plan azaltmak yardımcı olur, olmak uyarı da floresan protein foton verim azalmasına neden olabilir. Alternatif arka plan sinyal görüntü analizi önce azaltmak aracı olarak arka plan çıkarma analizi sırasında kullanılabilir.
Drosophila belirli protein fonksiyon incelenmesi için köklü genetik araçları sağladığından vivo içinde görüntüleme için ideal bir organizma sunar. Ters yönde harekete geçirmek sıra (UAS)-Gal4 sistemi proteinlerin zamansal ve mekansal ifade sağlar ve bu nedenle neurotransmission23, işlemek için kullanılabilir öyle ki termo-genetik stimülasyon Drosophila geçici kullanma reseptör olası alt aile A1 (dTRPA1)24 veya opto-genetik uyarı far kırmızı kaymıştır CsChrimson25 kullanarak14Imaging ile birleştirilebilir. Vivo içinde tek molekül görüntüleme programında küçük bir sistem performans komplikasyonlar çoğunun üstesinden var ve şimdi nasıl tek-parçacık izleme Drosophila melanogaster üçüncü INSTAR larva içinde yürütülen olabilir açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı tek molekül izleme Drosophila Üçüncü INSTAR larva nöromusküler kavşakta mEos2 öğesini proteinlerin açıklar. Transgenik proteinin aşırı ifade önlemek için sözdiziminin-1A-mEos2 ifade endojen sözdiziminin-1A düzenleyici tarafından tahrik edildi. Sinaptik protein hareketlilik çalışmalar çoğunlukla kültürlü hücrelerin ve kortikal nöronlar9,11,12,13 vitro araştırmalar için sınırlı olmuştur. Bu proteinler canlı hayvan benzer hareketlilik imzalarında sergi büyük ölçüde bilinmiyor. Tek-protein hareketlilik içinde vivogörselleştirmek için aşılması gereken optik şeffaflık, erişilebilirlik ve penetrasyon derinliği gibi kısıtlamalar bulunmaktadır. Larva hazırlık anatomi ve kas yüzeyinde gömülü nöromüsküler kavşak görüntülenmesi, optik şeffaflık ve erişilebilirlik sorunu kaçının. Görüntü tek molekül hareketlilik normal TIRF yapılandırma girişimleri başarısız oldu. Ancak, hafifçe eğik aydınlatma için artan uyarma lazer derinlemesine nüfuz sağlar. Ayrıca, larva hareketsiz için kullanılan minutien iğne anestezik kullanım mümkün herhangi bir olumsuz etkisi protein hareketliliği üzerine önlemek için yardımcı oldu. Tek molekül içinde vivogörselleştirmek için 100 x yağı daldırma hedefleri, gibi daha yüksek büyütme hedefleri kullanmak mümkündür. Ancak, artan büyütme sürüklenir yak²n oluşumu artabilir. Buna ek olarak, biz-si olmak kullanılmış daha düşük yoğunluklu (~ %30) 561 nm lazer motor sinir terminallerinde görüntü tek moleküller için başarılı bir şekilde. Ek sınama daha düşük lazer güç kullanmak için gerekli.
Bu iletişim kuralı nöronal plazma zarı yakınlık içinde sinaptik proteinler hareketliliğini görselleştirmek uygundur. Bu yaklaşımı kullanarak, SNARE proteini – sözdiziminin-1A ve protein Atg18a bağlı autophagosome – hareketliliğini başarıyla görüntülü içinde vivo14,26olmuştur. Motor nöron aksonlar da olabilir proteinler hareketliliğini27araştırıldı. Ancak, soruşturma beyin veya ventral sinir kordonu proteinlerin hareketlilik nedeniyle temel doku tarafından üretilen yüksek arka plan sinyal değerlendirmek zor olabilir; Buna ek olarak, protein hareketlilik aynı beyin yapısı üzerinde görüntülenmesi fluorescently etiketleme (Yinelenebilirlik) sağlamak için beyin yapısı gerektirir ve çift-kamera görüntüleme kullanımını gerekli olacaktır.
Yerine daha üçüncü INSTAR larva38,39geliştirilen Drosophila süper çözünürlük mikroskopi için kullanılabilen geçerli yöntemleri çoğunlukla görüntüleme embriyolar için sınırlıdır. Bu protokoller ile ana konu onlar yörüngeleri görüntüsü alan az sayıda verim ve dolayısıyla hareketlilik Birleşik22,40derinlemesine analiz önlemek olduğunu. İletişim kuralı izleme bizim vivo içinde tek molekül yörüngeleri yüksek bir sayı üretmek için kapasitesine sahiptir ve bu nedenle Caenorhabiditis elegans ve Zebra balığı gibi diğer hayvan modellerinde kullanılabilir. Gerçekten de, her NMJ zinciri farklı mobil durumları ve geçişleri bu Birleşik14,27arasında analiz etmek için uygun hale ~ 2400 yörüngeleri oluşturulur. Ayrıca, birçok vivo içinde tek molekül görüntüleme stratejileri olan altında görüntüleme yapılır fizyolojik işlevi değiştirmek hayvan20,22, hareketsiz anestezi kullanımını güveniyor. Burada minutien iğne kullanarak larvaları hareketsiz bir ‘anestezi-ücretsiz’ protokolü optimize.
Bu iletişim kuralı bir potansiyel kullanımı proteinler üç boyutlu hareketliliğini görüntülenmesi için olabilir. Süper çözünürlük mikroskobu son gelişmeler izin görüntülenmeyecektir vitro ‘x’, içinde olmak protein hareketlilik ‘y’ ve ‘z’ boyutları41,42. Geçerli yöntem için hareket eden ‘z’ ekseninde proteinlerin hesaba katmaz. Henüz Drosophila motor sinir terminal küresel bir yapıdır ve protein hareketlilik bir üç boyutlu ses43ölçmek için değerli bir gelecek yaklaşım olacaktır. Z-boyut görüntüleme astigmatik bir lens ile mümkün olabilir. Alternatif olarak, TIRF modu44,45‘ z-çözünürlük da arttırılır. Ancak, bizim deneyler, syntaxin1A-mEos2 astigmatik lens olmadan tek molekülleri görselleştirmek için hafifçe eğik aydınlatma kullandık.
Sonuç olarak, proteinler ifade hem de bir transgenik Drosophila sinek stok kullanılabilirliğini değiştirme imkanı ile donatılmış TIRF mikroskop yanı sıra transgenik larva incelemek için bir photoconvertible protein, bir PDMS temel ile etiketlendi aydınlatma açısını tek proteinler bu protokol için açıklandığı gibi görselleştirmek için gerekli en önemli araç vardır.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Jean-Baptiste Sibarita ve Daniel Choquet (IINS, CNRS/Bordeaux Üniversitesi) tek molekül analizi ile tür destek için teşekkür ederiz. Nick Valmas özellikle teşekkür ediyoruz ve Jessica Mcgaw (QBI, Queensland Üniversitesi) video ile onların yardım için kayıt, ses hem de grafik tasarım rakam. Bu eser Avustralya Araştırma Konseyi (AR) keşif project tarafından desteklenmiştir (F.A.M. DP170100125), Avustralya Araştırma Konseyi (LIEF Grant LE0882864, F.A.M.) gelecek arkadaş grubu (B.V.S. FT100100725), Avustralya Araştırma Konseyi (LIEF Grant LE130100078 F.A.M için.) ve NHMRC Projesi (B.V.S. APP1103923) verin. F.A.M. NHMRC üst düzey araştırma görevlisi (ONT1060075) olduğunu.
Materials
| PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Glass-bottomed Culture Dish | In Vitro Scientific | D29-20-1.5-N | |
| Optical Stereo-microscope | Olympus | SZ51 | |
| Curved Tweezers (Style 5/45) | Electron Microscopy Sciences | 0208-5AC-PO | |
| Minutien Pins (0.1mm) | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Schneider's Insect Medium | Sigma, Life Sciences | S0146 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Fine Forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| ELYRA PS.1 Microscope | Zeiss | PS.1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-515Q | |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| Normal Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) | Axygen | MCT-175-C | |
| Zen Black acquisition software | Carl Zeiss, 2012 | ||
| Metamorph software | Molecular Devices | 7.7.8 | PALM Tracer Plugin |
| Fly strain | w1118; HA-Sx1A-mEos2 | ||
Referencias
- Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
- Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
- Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
- Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
- Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
- Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
- Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
- Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
- Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
- Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
- Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
- Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
- Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
- Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
- Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
- Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
- Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
- Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
- Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
- Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
- Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
- Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
- Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
- Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
- Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
- Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
- Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
- Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
- Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
- Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
- Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
- Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).
