JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

В естественных условиях Одноместный молекула отслеживания на терминале Пресинаптический двигательного нерва дрозофилы

Published: January 14, 2018
doi:
10.3791/56952
, , , , ,
1Clem Jones Centre for Ageing Dementia Research, Queensland Brain Institute,The University of Queensland, 2VIB Centre for Brain and Disease Research, KU Leuven Department of Neurosciences,Leuven Institute for Neurodegenerative Disease (LIND), 3Queensland Brain Institute,The University of Queensland

Summary

Здесь мы показываем как одной молекулы фото активированный локализации микроскопии может осуществляться на терминале двигательного нерва живой Drosophila melanogaster третий Инстар личинки.

Abstract

Все большее количество суперразрешением микроскопии методы помогают раскрыть механизмы, которые управляют наноразмерных клетчатом мире. Одноместный молекула изображений набирает обороты, как он предоставляет исключительный доступ к визуализации отдельных молекул в живых клетках. Здесь мы опишем технику, которую мы разработали для выполнения одной частицы отслеживания фото активированный локализации микроскопии (sptPALM) у дрозофилы личинок. Синаптической связи основывается на ключевых Пресинаптический белки, которые действуют путем прикрепления, грунтовка и содействия синтез содержащих нейромедиатор везикулы с плазматической мембраны. Широкий спектр взаимодействия протеин протеина и белково липидные жестко регулирует эти процессы и Пресинаптический белки поэтому демонстрируют изменения в мобильности, связанный с каждым из этих ключевых событий. Расследование, как мобильность этих белков коррелирует с их физиологической функцией в нетронутой живой животное имеет важное значение для понимания их точный механизм действия. Извлечение мобильности белка с высоким разрешением в естественных условиях требует преодоления ограничений, таких как Оптическая прозрачность, доступность и глубину проникновения. Мы описываем, как photoconvertible флуоресцентные белки, отмеченных в пресинаптическом белка Синтаксин 1A может быть визуализирована через небольшой наклонный освещения и отслеживается на терминале двигательного нерва или вдоль аксона мотонейрона третьего Инстар дрозофилы Личинка.

Introduction

Нейронные связи опирается на нейромедиатора релиз, в котором происходит через регулируемые синтез содержащих нейромедиатор синаптических пузырьков с плазматической мембраны1. Этот процесс называется экзоцитоз2,3,4,5,6 очень динамичен и может быть вверх или вниз регулируемой согласно колебания курса стимуляции7. Белков, участвующих в этих процессах подлежат броуновского движения и таким образом отображать наноструктурном Организации, способной выдержать ряд обязательных действий, которые лежат в основе этих физиологических функций. Белки плазмы мембраны очень динамичный, позволяя бокового захвата молекул в нанокластерами на плазматической мембране7,8,9,10,11, 12. Таким образом расследование мобильности этих белков помогает прояснить их режим действий8. Синаптических белков, таких как растворимые N-ethylmaleimide чувствительным фактором вложения белок рецепторы (ловушки), например Синтаксин 1A, теперь известны демонстрируют боковой быстро мобильности, а также боковые треппинга в пределах нанокластерами, который может служить как молекулярная складов и мест для везикул фьюжн9,13,14,15.

Недавнее развитие photoconvertible флуоресцентных белков, таких как мономерные (m) Eos16,17 и18Каэдэ позволила наноструктурном резолюции нейрональных плазмы мембранных белков с помощью подходов таких как фото активированный локализации микроскопии (PALM) и стохастические оптических реконструкции микроскопии (шторм)14,15,19. Эти события позволили расследования мобильность и nanoclustering биологических белков в культивировали живые клетки и нейроны. Совсем недавно были проведены исследования для выяснения (на аналогичных высоких разрешениях) динамика и организации этих мембранных белков в нейронах живых организмов нетронутыми такие Mus musculus, Caenorhabditis elegans и Drosophila melanogaster14,20,21,22.

Изучение динамики и организации белка в естественных условиях требует не только использования недавно разработанных суперразрешением изображений инструментов (таких как пальмы, буря и photoconvertible флуорофоров), но также способность преодолевать препятствия такой как доступность белка и глубина проникновения изображений лазера. Imaging внутриклеточных белков в неповрежденной животное изначально сложным, как изображений белков на структуры, встроенных глубоко в живых тканях нетронутыми животного, например гиппокампа нетронутыми мыши. Следовательно более легко отражаются белки на или вблизи поверхности ткани. Еще одна трудность с imaging в естественных условиях — в деле обеспечения воспроизводимости через животных. Как Анатомия может отличаться от одного образца на другой, выбрав структуру с легкостью репликации в различных образцах нетронутыми животных также может оказаться сложной задачей. Использование стереотипных структур, таких как синапсов, помочь в преодолении некоторых из этих трудностей.

Недавние исследования отображаемого подвижности белков в животных с оптически прозрачные эпидермис например Caenorhabditis elegans22, в то время как другие исследования образ Организации белков на поверхности ткани/органа, например Актин изображений в корковых нейронов через череп живут мыши21. В некоторых случаях обезболивающих средств были использованы для держать животное неподвижной; Однако конкретные анестетиков может отрицательно повлиять на протеина интереса. Альтернативные средства, чтобы сохранить животных неподвижной во время визуализации в естественных условиях следует изучить таким образом свести к минимуму ошибки.

Еще один нюанс суперразрешением изображений, в естественных условиях , что лазеры, используемые для освещения протеинов интереса может отрицательно сказаться на окружающие ткани, и таким образом сохраняя интенсивность возбуждения как можно ниже рекомендуется. Освещение окружающие ткани лазером также имеет тенденцию к увеличению фонового сигнала. Использование низких возбуждения интенсивности помогает снизить фон, оговоркой, что это также может привести к снижению урожайности Фотон флуоресцентный белок. Вычитание фона во время анализа могут использоваться как альтернативное средство для снижения фонового сигнала до анализа изображений.

Дрозофилы представляет идеальный организм для в vivo изображений как он обеспечивает налаженные генетических инструменты для расследования конкретных белков функции. Вверх по течению активации последовательности (УАС)-система Gal4 позволяет временных и пространственных экспрессию белков и поэтому может использоваться для манипулирования синапсах23, что термо генетические стимуляции с помощью дрозофилы переходных рецептор потенциальных суб семья А1 (dTRPA1)24 или опто генетические стимуляции с помощью смещается far красных CsChrimson25 может сочетаться с изображений14. Мы преодолеть многие из осложнений выполнения в vivo сингл молекула изображений в этой системе и теперь описать как сингл частица отслеживание может осуществляться в Drosophila melanogaster третьего возраста личинок.

Protocol

1. дизайн трансгенных дрозофилы выражения с меткой mEos2 белков Выберите белка, чтобы быть помечены с белком mEos2. Чтобы увеличить скорость обработки изображений успеха, выберите белки с доменом трансмембранного в нейрональных плазматической мембраны14 (например, Синтаксин 1A), белки на синаптических пузырьков или autophagosomes26,27 (например, Synaptobrevin-2), или цитозольной белки с тесное взаимодействие с белками плазмы мембране нейронов (например, Munc18-1). Постройте трансгенов, шифруя протеин тегами mEos2 (рис. 1). Дизайн прямого и обратного Праймеры для белков и mEos2.Примечание: MEos2 кодирующая последовательность может быть усилена с pmEos2-N1 плазмида, который предназначен для предохранителя для C-конечная протеина интереса. Клонирование например могут быть выполнены путем рекомбинации в естественных условиях в Saccharomyces cerevisiae с помощью pFL44S-attB-MCS-w + вектор14,28, попеременно могут использоваться другие методы клонирования как Гибсон Ассамблея протокол29. Линеаризации вектор с BamHI и XbaI и совместно превратить в ura3 – дрожжевых клеток вместе с ПЦР фрагментов кодировки mEos2 и протеина интереса. Придать дрозофилы эмбрионов с помощью конструкции для создания трансгенных летать линии30. Задние трансгенных культур летать на стандартных дрожжей и мелассы среднего или некоторые другие подходящую замену, содержащихся в пластиковых флаконах. Для обеспечения здоровой и довольно большой синаптической boutons31, избежать переполненности мух в ампул и флип мух для новых флаконах после каждого дня откладки; Это гарантирует третьего возраста личинок кормят хорошо и достичь надлежащего размера к времени, когда они начнутся, блуждающих на носителе. Поднимите трансгенных летать при комнатной температуре (25 ° C).Примечание: Большие синаптической boutons, как правило, дают большее количество белков, визуализируется во время визуализации. 2. рассечение третьего Instar личинка Сделайте цилиндрическую или semicylindrical формы полидиметилсилоксан (PDMS) базовый ≤20 мм в диаметре и ≤20 мм в высоту, с помощью соответствующего силиконовые эластомера kit (рисунок 2A). Mix силиконового эластомера с силиконовой отвердителя в соотношении 10:1. Перемешайте смесь тщательно для 5 минут залить смесь в форму с dimsensions, перечисленных выше. Пусть это затвердевают в духовке при 100 ° C на 45 мин. PDMS база будет служить основой для проведения вскрытия. Обеспечения, база PDMS вписывается в хорошо прозрачным дном культуры блюдо. Выберите блуждающих третьего instar личинка стенке флакона. Используйте оптический стерео Микроскоп на 4,5 увеличение визуализировать личинка, размещены на базе PDMS цилиндрические с спинной стороне вверх. Использование изогнутые и угловые пинцет придерживаться minutien штыри на голове над рот крючки, между ними передней дыхальца, расширяя и на хвосте через анус, между двумя задние дыхальца. 40 мкл Шнейдера насекомых среднего, при комнатной температуре на иммобилизованных личинка.Примечание: Hemolyph как решения (HL3 или HL6) может также использоваться вместо Шнейдера решения32,33. Предоставлять доступ через спинной стороне брюшной стенки тела личинки, использование ПИН-кода minutien для надрезать в средней линии стены. Использование весной ножницы, чтобы вырезать стенки тела открыть от точки разреза. Разрежьте вдоль средней линии в направлении передней задней34. Использование тонкой щипцами и пружинные ножницы для потрошить личинка: удаление внутренних органов, включая слюнных желез, трахею и кишечнике. Вымойте личинка дважды с Шнейдера насекомых средой. С тонкой щипцами удерживайте две стенки тела закрылки, мягко растянуть их вне и придерживаться двух minutien контактов на каждой стороне. Это следует производить с шестигранной формы подготовки (рисунок 2A). Отсоединить мозг от воспалении брюшины шнур, с помощью ножниц весной для уменьшения возможности движения мышц во время визуализации; Это также служит для проведения подготовки плоский против изображений блюдо. Для проталкивания все шесть minutien контакты в базу PDMS используйте Изогнутый пинцет.Примечание: Только небольшую часть контакты должны быть внедрены в брюшной стенки. Чтобы подтвердить, что личинка пережил процедуру диссекции, слегка совать шнур воспалении брюшины, это должно выявить перистальтического сокращения личинка брюшной стенки. 3. слегка косо освещения сингл частица отслеживания микроскопия Инвертируйте базу расчлененных личинка PDMS на прозрачным дном культуры блюдо. Заполните изображений блюдо с 2 мл комнатной температуре Шнайдер насекомых среды (рис. 2B). Найдите двигательных нейронов в втором и третьем сегментах с синапсов на мышцы живота, 6 и 735 с помощью 63 x / 1,2 Цель NA погружения в воду на микроскопе флуоресцирования (TIRF) флуоресцентных полного внутреннего отражения. Используйте окуляры микроскопа для поиска расчлененных личинка; Определите мышцы 6 с использованием яркой области освещения. Использовать программное обеспечение приобретение микроскопа (см. Таблицу материалы), TIRF конфигурации; слайд угол камеры коллиматор 1 ° для увеличения глубины проникновения, в противном случае выйти из TIRF критический угол для достижения наклонный освещения. Включите 488 нм лазер для визуализации mEos2 зеленым цветом. Используйте мощность лазера низкой (менее 5% 22,8 МВт) во избежание обесцвечивания зеленой флуоресценцией. Найдите нервно узлов (которые выглядят как бусы на строку) и приобрести TIRF изображение с низким разрешением. Одновременно включается 405 нм лазер (photoconverts mEos2 от зеленого до Красного видов) и 561 Нм лазер (изображение photoconverted красный mEos2) ковшах локализовать одного mEos2 флуоресцентных белков.Примечание: Рекомендуется использование маломощных 405 нм лазер (0,005 до 0,9% 4,78 МВт) как это позволяет для скорости относительно постоянной photoconversion во время приобретения фильма. Между 50 и 75% 561 Нм лазер (20,1 МВт), как это достаточно приобрести флуоресценции Красного mEos2 видов без ущерба морфология вокруг перекрестка нервно-мышечной ткани. Для каждой цепи нервно-Джанкшн приобрести время серии, состоящий из 15 000 кадров или более 33 Гц. as.czi формат сохранения для сохранения сопутствующих мета данные для возможного использования. Используйте ImageJ с конвертировать файлы фильмов «.czi» в «TIFF»-файлов. Анализировать приобретенные фильмы с подходящим сингл молекула отслеживания аналитического программного обеспечения11,,1436 таких TrackMate на Фиджи/ImageJ37 (см. Таблицу материалы). Находит «x» и «y» координаты каждой локализации по Гауссу fit интенсивность точки распространения функция (PSF).Примечание: Устранение неполадок: Если зеленая Флуоресценция не наблюдается или слишком тусклый, на перекрестке нервно под воздействием 488 нм лазер, кратко перейти на photoconverting и визуализации лазеры (405 нм и 561 Нм), как это помогает производить больше Красного видов mEos2. Затем переключитесь обратно на 488 нм лазер и взять образ TIRF. 4. single молекула локализации в фиксированных личинки Измерить размер нанокластерных белка через ладонь, замените Шнайдер насекомых среднего после вскрытия с фиксатором – параформальдегида 4% разбавленный-фосфатный буфер (PBS). Инкубируйте личинка на 30 минут при комнатной температуре. Удаление рассечение булавки и фиксированной личинка в 1,7 мл Снимите пробки microcentrifuge оснастки lock. Вскрыть и исправить, как многие другие личинки по мере необходимости, затем вымыть их три раза с PBS. Замените блок буфера (раствор PBS, 0,1% тритон X-100 и 3% нормальной козьего сыворотки) PBS. Вымойте личинки с PBS три раза, а затем инкубации с необходимыми основное антитело (разбавленный раствор буфера блока). Инкубируйте на ночь на 4 oC. Вымойте личинки три раза с PBS, затем инкубации с необходимыми вторичное антитело (разбавленный раствор буфера блока). Вымойте личинки три раза с PBS, приложите личинка обратно на PDMS базы и изображения, как описано для отслеживания одной молекулы.

Representative Results

Используя протокол, перечисленных выше, Синтаксин 1A-mEos2 трансгенных Drosophilamelanogaster были созданы (рис. 1). Трансгенные третий Инстар дрозофилы личинки были расчленены на базе PDMS цилиндрические (рисунок 2A-F). Чтобы визуализировать одной молекулы Синтаксин-1а, мы использовали PALM на TIRF микроскопа с слегка косо лазерной подсветки14. Одной молекулы Синтаксин 1A были отслежены на терминалах Пресинаптический двигательного нерва на мышцу 6 второй брюшной сегмент. Зеленая Флуоресценция mEos2 могут быть обнаружены как показано с низким разрешением изображения Синтаксин 1A-mEos2 на boutons тип 1b при возбуждении, используя 488 нм лазер (рис. 3A). В тепловизионных экспериментах, 405 нм и 561 Нм возбуждения лазерной обработки изображений глубины были 133,5 Нм и 165.6 Нм, соответственно. Зеленый образ был приобретен как в среднем 16 отдельных кадров. Этот зеленый образ был использован для создания области интереса, используемых для ограничения анализа локализаций в фильме photoconverted на пресинаптическом двигательного нерва клеммы только. Анализ приобретенного photoconverted sptPALM фильмы создаются супер решена интенсивности, коэффициент диффузии, и траектории карты (рис. 3A). Синтаксин 1A-mEos2 мобильности был далее количественно методом анализа среднеквадратичной перемещения (MSD) индивидуальных траекторий (рис. 3B). Статистические сравнения может быть сделано с помощью площадь под кривой MSD (рис. 3B). Дальнейший анализ мобильности дает распределение коэффициента диффузии Синтаксин 1A-mEos2, и это статистически оцениваться путем сравнения мобильных неподвижной населению (рис. 3 c). Рисунок 1 : Создание mEos2-тегами конструкций. PFL44S-attB-MCS-w + вектор линеаризованных с BamHI и XbaI. Перекрывающиеся полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагменты, шифруя протеин интереса (POI) и mEos2, соответственно, можно клонировать, например, в естественных условиях рекомбинации в ura3 – дрожжевых клеток или Ассамблеей Гибсон. Обратите внимание, что для создания Синтаксин 1A-mEos2 трансген, мы клонирован конструкции, обрамленная эндогенного Синтаксин 1A промоутер и Терминатор последовательности. Результирующая структура впоследствии могут быть введены в дрозофилы эмбрионов для создания трансгенных летать линии выражения протеина интереса (POI) сливается с mEos2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Дрозофила личинка диссекции и косые освещения. (A) схема дрозофилы личинка рассечение осуществляется на базе полуцилиндрические PDMS. Larva филе был проведен на PDMS гель с использованием minutien штыри. (B-C) Личинка PDMS prep был помещен внутри прозрачным дном культуры блюдо, содержащие Шнейдера насекомых среднего. Микроскопом TIRF в конфигурации слегка косо освещения была использована для визуализации Синтаксин 1A-mEos2 в терминалах двигательного нерва. (D-F) Полуцилиндрические PDMS база с расчлененных дрозофилы личинки. Личинка PDMS подготовки был помещен в визуализации блюдо, наполненный Шнейдера среднего, и личинки было imaged на микроскопе PALM суперразрешением. Линейки, 10 мм., (эта цифра была изменена с14). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : В естественных условиях Отслеживание Синтаксин 1A-mEos2 на пресинаптическом двигательного нерва терминала. (A) A разрешением TIRF изображение Синтаксин 1A-mEos2 на тип 1b двигательного нерва терминала. Анализ photoconversion фильмов образы на 33 Гц генерируется sptPALM супер-решена интенсивности, коэффициент диффузии и траектории карты. 5,309 индивидуальных траекторий были фотосъемка приобретения более 16 000 кадров фильма. Линейки, 3 мкм. (B-C) Среднеквадратическая перемещения (MSD) Синтаксин 1A-mEos2 был заговор от 6 различных двигательного нерва терминалы; Площадь под кривой (AUC) MSD был использован для количественного определения уровня мобильности. Распределения коэффициента диффузии показывает мобильных и неподвижным Синтаксин 1A населения, которые могут быть количественно как коэффициенты друг от друга; в среднем ~ 2400 траекторий были получены за двигательного нерва терминала (n = 3 личинок). Данные представлены как средние Среднеквадратичная ошибка среднего. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол описывает сингл молекула отслеживания mEos2-тегами белков на нейромышечную стыке дрозофилы третьего возраста личинки. Чтобы избежать гиперэкспрессия трансгенных белка, Синтаксин 1A-mEos2 выражение был обусловлен эндогенного промоутер Синтаксин 1A. Исследования мобильности синаптических белков основном были ограничены в vitro исследования культивируемых клеток и корковых нейронов9,11,12,13. Ли эти белки демонстрируют аналогичные подписи мобильности в живое животное практически неизвестны. Чтобы визуализировать сингл белка мобильности в естественных условиях, ограничения, такие как оптическая глубина проникновения, прозрачности и доступности необходимо будет преодолеть. Рассекает личиночной подготовки и визуализации нервно развязок, внедренные на поверхности мышц, мы избежать проблемы оптической прозрачности и доступности. Попытки изображения одной молекулы мобильности в обычной конфигурации TIRF оказались безуспешными. Однако использование слегка косо освещения позволяет для увеличения возбуждения лазера проникают в глубину. Кроме того minutien контакты, используемые для иммобилизации личинка помог избежать любых возможных неблагоприятных последствий проведения анестезии использования белка мобильности. Это позволяет использовать выше увеличение целей, таких как 100 x нефть погружения целей, чтобы визуализировать одной молекулы в естественных условиях. Однако увеличение масштаба может увеличить возникновение сугробы вне фокуса. Кроме того мы использовали снижение интенсивности (~ 30%) 561 Нм лазер успешно изображение одной молекулы на терминалах двигательного нерва. Использовать меньше мощности лазера, может потребоваться дополнительное тестирование.

Этот протокол является подходящей для визуализации мобильности синаптических белков в близости нейрональных плазматической мембраны. Используя этот подход, мобильность SNARE белка – Синтаксин 1A и связанные белком Atg18a autophagosome – были успешно фотосъемка в vivo14,26. Подвижности белков на мотонейрона аксоны также могут быть исследованы27. Однако исследование подвижности белков на мозг или воспалении брюшины шнур может оказаться трудно оценить из-за высокой фонового сигнала, производимые в основной ткани; Кроме того визуализации подвижности белков на той же структуры мозга потребует дневно тегов структуры мозга (для обеспечения воспроизводимости), и будет необходимо использовать двойной камеры изображения.

Текущие методы, доступные для микроскопии суперразрешением у дрозофилы в основном ограничиваются изображений эмбрионов, вместо того, чтобы более развитые третьего возраста личинок38,39. Основная проблема с этими протоколами, что они дают небольшое количество траекторий в зоне образы и таким образом предотвратить углубленный анализ мобильности государства22,40. Наши в естественных условиях одной молекулы отслеживания протокол имеет способность генерировать большое количество траектории и поэтому могут быть использованы в других животных моделей, таких как Caenorhabiditis elegans и данио рерио. Действительно каждый NMJ цепи генерируется ~ 2400 траекторий, что делает его пригодным для анализа различных мобильных состояний и переходов между этими государствами14,27. Кроме того многие в естественных условиях одной молекулы визуализации стратегии полагаются на использование анестетиков обездвижить животных20,22, который может изменять физиологические функции, под которым делается изображений. Здесь мы оптимизировали «анестезии свободный» протокол для иммобилизации личинки, с помощью minutien штыри.

Возможности использования этого протокола может быть для визуализации подвижности белков в трех измерениях. Последние достижения в микроскопии суперразрешением позволяют белка мобильности будет визуализирован в пробирке в «x», «y» и «z» размеры41,42. Наш текущий метод не учитывает подвижности белков в ось «z». Тем не менее дрозофилы двигательного нерва терминал является структурой сферической и ценный будущий подход будет для количественного определения белка мобильности в трехмерном объеме43. Изображений в измерении z является осуществимым с помощью астигматических линз. Кроме того в режиме TIRF44,45, z резолюции также увеличивается. Однако в наших экспериментах, мы использовали слегка косо освещения для визуализации одной молекулы syntaxin1A-mEos2 без астигматических линз.

В заключение, наличие обоих трансгенных дрозофилы летать запасов выражая белки отмеченных photoconvertible белок, PDMS базы вскрыть трансгенных личинок, а также TIRF микроскопа, с возможность изменения угол освещения являются наиболее важные инструменты, необходимые для визуализации одного белки, как описано в настоящем Протоколе.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Жан-Батист Sibarita и Даниэль Choquet (МИИПН, CNRS/Университет Бордо) за их поддержку с анализом одной молекулы. Мы особенно благодарим Valmas Ник и Джессика МакГоу (QBI, университет Квинсленда) за их помощь с видео записи, голос за кадром, а также рисунок графический дизайн. Эта работа была поддержана Австралийский исследовательский совет (AR) Открытие проекта (DP170100125 до Ф.А.М.), Австралийский исследовательский совет (LIEF Грант LE0882864 в Ф.А.М.), будущее стипендий (FT100100725 B.V.S.), Австралийский исследовательский совет (LIEF Грант LE130100078 к Ф.А.М.) и проект NHMRC Грант (APP1103923 B.V.S.). Ф.А.М. является NHMRC старший научный сотрудник (ONT1060075).

Materials

PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) Dow Corning Corporation 000000000001064291
Glass-bottomed Culture Dish In Vitro Scientific D29-20-1.5-N
Optical Stereo-microscope Olympus SZ51
Curved Tweezers (Style 5/45) Electron Microscopy Sciences 0208-5AC-PO
Minutien Pins (0.1mm) Fine Science Tools 26002-10
Schneider's Insect Medium Sigma, Life Sciences S0146
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11254-20
ELYRA PS.1 Microscope Zeiss PS.1
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza 17-515Q
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Normal Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) Axygen MCT-175-C
Zen Black acquisition software Carl Zeiss, 2012
Metamorph software Molecular Devices 7.7.8 PALM Tracer Plugin
Fly strain w1118; HA-Sx1A-mEos2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
  2. Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
  3. Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
  4. Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
  5. Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
  6. Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
  7. Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  8. Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
  9. Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
  10. Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
  11. Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
  12. Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
  13. Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
  14. Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
  15. Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
  16. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  17. Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
  18. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  19. Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
  20. Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
  21. Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
  22. Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
  23. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  25. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  26. Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
  27. Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
  28. Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  30. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  31. Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
  32. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
  33. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
  34. Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
  35. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  36. Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  37. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  38. Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
  39. Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
  40. Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
  41. Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
  42. Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
  43. Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
  44. Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
  45. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Tags

Single-molecule TrackingDrosophilaPresynaptic Motor Nerve TerminalIn VivoPhotoconvertible FluorophoreSchneider’s Insect MediumDissectionSylgard BaseTIRF MicroscopyNeuromuscular Junctions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Bademosi, A. T., Lauwers, E., Amor, R., Verstreken, P., van Swinderen, B., Meunier, F. A. In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal. J. Vis. Exp. (131), e56952, doi:10.3791/56952 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image