JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociencias

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

Published: January 14, 2018
doi:
10.3791/56952
, , , , ,
1Clem Jones Centre for Ageing Dementia Research, Queensland Brain Institute,The University of Queensland, 2VIB Centre for Brain and Disease Research, KU Leuven Department of Neurosciences,Leuven Institute for Neurodegenerative Disease (LIND), 3Queensland Brain Institute,The University of Queensland

Summary

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

Abstract

מספר גדל והולך של טכניקות במיקרוסקופ סופר רזולוציה מסייעים לחשוף את המנגנונים המפקחים על העולם הסלולרי ננו. מולקולה בודדת הדמיה הוא צובר תאוצה כפי שהיא מספקת גישה יוצאת דופן הפריט החזותי של מולקולות בודדות בתאים חיים. כאן, אנו מתארים את הטכניקה שפיתחנו כדי לבצע מעקב יחיד-חלקיקים לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (sptPALM) בהזחלים דרוזופילה . סינפטית תקשורת מסתמך על חלבונים presynaptic מפתח שפועלים על ידי עגינה, הטרמה, קידום הפיוז’ן של המכילים נוירוטרנסמיטר שלפוחית עם קרום פלזמה. מגוון רחב של אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-ליפיד בחוזקה מווסת תהליכים אלה ולהציג החלבונים presynaptic ולכן שינויים הניידות המשויכים כל אחד המאורעות מפתח. חוקרים כמה ניידות של חלבונים אלה להרכב שלהם תפקיד פיזיולוגי, חיה חיים שלמים חיוני להבנת מנגנון הפעולה המדויק שלהם. חילוץ חלבון ניידות עם רזולוציה גבוהה ב- vivo דורשת התגברות על מגבלות כגון שקיפות אופטית, נגישות, עומק החדירה. נתאר כמה חלבונים פלורסנט photoconvertible מתויג כדי החלבון presynaptic Syntaxin-1A ניתן דמיינו באמצעות תאורה עקיפה קלה, מעקב אחר בתחנה עצבים מוטוריים או לאורך האקסון של נוירון מוטורי השלישית של instar דרוזופילה זחל.

Introduction

תקשורת עצביים מסתמך על שחרור נוירוטרנסמיטר, אשר מתרחשת באמצעות היתוך גרעיני מוסדר של המכילים נוירוטרנסמיטר הסינפטיות עם קרום פלזמה1. זה תהליך הנקרא אקסוציטוזה2,3,4,5,6 הוא דינמי מאוד והוא יכול להיות למעלה או למטה-מוסדר על פי תנודות בשיעור של גירוי7. החלבונים המעורבים בתהליכים אלה כפופים תנועה בראונית ולהציג ולכן nanoscopic הארגון לשמר מגוון של איגוד פעולות לחזק אלה פונקציות פיזיולוגיים. קרום פלזמה חלבונים הם מאוד דינמי, המאפשר רוחבי השמנה של מולקולות אל תוך nanoclusters קרום פלזמה7,8,9,10,11, 12. ככזה, חוקרים את הניידות של חלבונים אלה מסייעת להבהיר שלהם למצב של פעולה8. חלבונים סינפטיים כגון מסיסים N-ethylmaleimide פקטור רגיש מצורף חלבון הקולטנים (מלכודות), לדוגמה Syntaxin-1A, ידועים כעת שהפגינו ניידות מהירה רוחבית, כמו גם לרוחב השמנה nanoclusters שיכול לשרת כמו מולקולרית מחסני ואתרי שלפוחית פיוז’ן9,13,14,15.

ההתפתחות האחרונה של חלבונים פלורסנט photoconvertible, כגון monomeric (ז)16,Eos17 קאךה18, אפשרה את הרזולוציה nanoscopic של קרום פלזמה עצביים חלבונים באמצעות גישות כאלה לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ (דקל), שחזור אופטי סטוכסטי מיקרוסקופ (סערה)14,15,19. התפתחויות אלה אפשרו חקירות לתוך הניידות ואת nanoclustering של חלבונים ביולוגי בתרבית תאים חיים, נוירונים. לאחרונה, מחקרים בוצעו להבהיר (ברזולוציות דומה גבוהה) הדינמיקה והארגון של חלבונים אלה ממברנה בתוך הנוירונים של אורגניזמים חיים שלמים כזה . מאסכאלאס, Caenorhabditis elegans, ו- דרוזופילה melanogaster14,20,21,22.

חוקרים את הדינמיקה והארגון של יישום חלבון ויוו דורשת לא רק שימוש הכלים שפותחו לאחרונה סופר-רזולוציה הדמיה (כגון דקל, סערה, photoconvertible fluorophores), אלא גם את היכולת להתגבר על מכשולים כאלה כמו נגישות של החלבון ואת עומק החדירה של הלייזר הדמיה. הדמיה חלבונים תאיים על חיים שלמים הוא מטבעו מאתגר כמו זה הדמיה חלבונים על מבנים מוטבע עמוק בתוך רקמות החיים של החיה ללא פגע, כגון ההיפוקמפוס עכבר ללא פגע. לפיכך, חלבונים או קרוב לפני השטח של הרקמה הם צילמו בקלות רבה יותר. קושי נוסף עם דימות in vivo הוא הבטחת הפארמצבטית מעבר בעלי חיים. כפי האנטומיה עלולות להיות שונות דוגמא אחת לאחרת, בחירת מבנה בקלות של שכפול בדגימות שונות בבעלי חיים שלמים גם להוכיח מאתגר. השימוש של מבנים סטריאוטיפית, כגון synapses, לעזור עם התגברות על קשיים אלה.

מחקרים שנעשו לאחרונה יש תמונה חלבון ניידות בבעלי חיים עם האפידרמיס שקוף אופטית כגון Caenorhabditis elegans22, בזמן חקירות אחרות יש תמונה ארגון החלבונים על פני השטח של איבר/רקמות, לדוגמה הדמיה אקטין בנוירונים בקליפת המוח דרך הגולגולת של העכבר חי21. במקרים מסוימים, הרדמה שימשו כדי לשמור את החיה משותק; עם זאת, הרדמה מסוים עשוי להשפיע לרעה החלבון עניין. לפיכך לבחון אמצעים חלופיים כדי לשמור על חיות משותק במהלך דימות ויוו כדי למזער את השגיאה.

אזהרה נוספת כדי סופר-רזולוציה הדמיה ויוו היא לייזרים המשמש כדי להאיר את החלבונים עניין עלול להשפיע לרעה את הרקמה שמסביב, ולכן שמירה על עוצמת עירור נמוך ככל האפשר מומלץ. תאורה של הרקמה שמסביב על ידי הלייזר גם נוטה להגביר את האות רקע. השימוש בעוצמה נמוכה עירור מסייעת להפחית את הרקע, לפרסמה להיות זה עלול להוביל לירידה התשואה פוטון חלבון פלואורסצנטי. רקע חיסור במהלך ניתוח יכול לשמש אלטרנטיבה אומר להפחית את האות רקע לפני ניתוח תמונות.

דרוזופילה מציג אורגניזם אידיאלי ויוו הדמיה כפי שהיא מספקת כלים גנטיים ומבוססת על חקירת פונקציה של חלבונים ספציפיים. הרצף הפעלת נגד הזרם (UAS)-מערכת Gal4 מאפשרת הבעה טמפורלית המרחבי של חלבונים, ולכן ניתן לתמרן עצבית23, כך התרמו-גנטית גירוי באמצעות דרוזופילה ארעית המשפחה תת פוטנציאלי קולטן A1 (dTRPA1)24 או באופטו-גנטית גירוי באמצעות far-red-העביר CsChrimson25 יכול להיות משולב עם הדמיה14. אנו היה להתגבר על הרבה סיבוכים של ביצוע ויוו מולקולה בודדת הדמיה במערכת זו, תאר איך מעקב יחיד-חלקיק יכול להתבצע בהזחלים לחלל השלישי melanogaster דרוזופילה .

Protocol

1. עיצוב של הטרנסגניים דרוזופילה המבטאים חלבונים מתויג mEos2 בחר את החלבון כדי להיות מתויג עם החלבון mEos2. כדי להגדיל את שיעור ההצלחה הדמיה, בחר חלבונים עם תחום transmembrane קרום פלזמה עצביים14 (למשל, Syntaxin-1A), חלבונים הסינפטיות או autophagosomes26,27 (למשל, Synaptobrevin-2), או חלבונים cytosolic עם אינטרקציה קרובה עם קרום פלזמה עצביים חלבונים (למשל, Munc18-1). לבנות transgenes קידוד החלבון מתויג mEos2 (איור 1). לעצב את ואחורה צבעי יסוד חלבונים ו- mEos2.הערה: רצף קידוד mEos2 יכול הגברה מן פלסמיד pmEos2-N1, אשר נועדה הפתיל קצה קרבוקסילי של החלבון עניין. שיבוט לדוגמה ניתן לבצע על ידי ויוו רקומבינציה ב האפייה בעזרת את pFL44S-attB-MCS-w + וקטור14,28, לסירוגין שיטות השיבוט אחרות יכול לשמש כמו גיבסון הרכבה פרוטוקול29. Linearize וקטור עם BamHI, XbaI, שותף להפוך ura3 – תאי שמרים עם השברים PCR קידוד mEos2 ו החלבון עניין. מזריקים עוברי דרוזופילה הבונה כדי ליצור קו לטוס הטרנסגניים30. אחורי התרבויות לטוס הטרנסגניים בינוני שמרים ומולסה רגיל או איזה תחליף מתאים אחרים הכלולים צלוחיות פלסטיק. כדי להבטיח גדולים למדי ובריאה עם העיתון ons סינפטית31, למנוע זבובים, צפיפות הבקבוקונים והפיכה של זבובים כדי בקבוקונים חדשים לאחר לכל יום להטלת ביצים; פעולה זו מבטיחה השלישי לחלל הזחלים ניזונים היטב ולהגיע בגובה המתאים עד שהם התחילו לנדוד על בינוני. הרימו את הזבוב הטרנסגניים בטמפרטורת החדר (25 ° C).הערה: עם העיתון ons סינפטית גדולים נוטים להניב כמות גדולה יותר של חלבונים דמיינו במהלך דימות. 2. ניתוח של זחל לחלל השלישי להפוך ≤20 הבסיס של polydimethylsiloxane בצורת גליל או semicylindrical (PDMS) מ מ קוטר, ≤20 מ מ, גובה באמצעות ערכת elastomer הסיליקון המתאימים (איור 2 א). מערבבים elastomer סיליקון עם סיליקון התקשות הסוכן ביחס של 10:1. מערבבים את התערובת היטב עבור 5 דק לשפוך התערובת לתוך תבנית עם dimsensions המפורטים לעיל. . תן לזה להקשיח בתנור ב 100 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. הבסיס PDMS יהווה הבסיס שעליו לבצע את ניתוח. להבטיח הבסיס PDMS משתלב הבדידות מאכל תת תרבות. בחר זחל נודד לחלל השלישי מהקיר המבחנה. השתמש סטריאו-במיקרוסקופ אופטי בהגדלה 4.5 להמחיש הזחל להציב בבסיס גלילי PDMS עם הצד הגבי למעלה. השימוש מעוקל, בזווית פינצטה לתקוע סיכות minutien על הראש מעל הפה ווים, בין השניים הרחבת spiracles הקדמי, ו על הזנב מעל פי הטבעת, בין spiracles האחורי שני. הוסף µL 40 של שניידר חרקים בינוני בטמפרטורת החדר אל הזחל קיבוע.הערה: פתרונות, כמו Hemolyph (HL3 או HL6) עשוי לשמש גם במקום של שניידר-פתרון-32,-33. מספקים גישה דרך הצד הגבי של קיר הגוף בטן של הזחל על ידי שימוש minutien pin כדי פצעים וחתכים לתוך האמצע של הקיר. שימוש מעיין מספריים כדי לגזור את הקיר הגוף תפתח נקודת החיתוך. חתך לאורך הקו האמצעי ב- הקדמי-את ישבנה לכיוון34. השתמש בסדר מלקחיים ואביב מספריים את המעיים הזחל: להסיר את האיברים הפנימיים, כולל בלוטות הרוק, קנה הנשימה, הבטן. לשטוף את הזחל פעמיים עם בינוני חרקים של שניידר. עם מלקחיים בסדר, תחזיק את המדפים קיר הגוף שני למתוח אותם החוצה ובעדינות לתקוע שני פינים minutien בכל צד. זה צריך לייצר תכשיר בצורת משושה (איור 2 א). לנתק את המוח של חוט עצבי הגחון באמצעות מספריים האביב כדי להקטין את האפשרות של תנועת השרירים במהלך דימות; זה משמש גם להחזיק את ההכנה שווידאתם המנה הדמיה. השתמש את הפינצטה מעוקלים כדי לדחוף את כל הפינים minutien שש לתוך הבסיס PDMS.הערה: רק חלק קטן של הפינים צריך להיות מוטבע בתוך קיר הבטן. כדי לאשר כי הזחל שרדה את ההליך לנתיחה, מעט לתקוע את חוט עצבי הגחון, זה צריך להפיק התכווצות סחרור לקיר הבטן זחל. 3. מעט אלכסונית תאורה יחיד-חלקיקים מעקב מיקרוסקופ היפוך הבסיס זחל גזור-PDMS על גבי צלחת תת תרבות. למלא את הצלחת הדמיה 2 מיליליטר חרקים בינוני של טמפרטורת החדר שניידר (איור 2B). לאתר מוטורי לגלוקוז בקטעים השני והשלישי עם הסינפסות על שרירי הבטן 6 ו-735 באמצעות ה-x 63 / 1.2 נה טבילה במי המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי גמורה קרינה פלואורסצנטית (TIRF). השתמש את עיניות במיקרוסקופ כדי לאתר הזחל גזור; לזהות שריר 6 על-ידי שימוש שדה בהיר תאורה. השתמש בתוכנת רכישה של מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים), בתצורת TIRF; החליקו את זווית המצלמה קולימטור 1° כדי להגדיל את עומק החדירה, אחרת תעבור זווית קריטית TIRF כדי להשיג תאורה עקיפה. . הפעילי את 488 ננומטר לייזר לדמיין mEos2 בירוק השתמש כוח לייזר נמוך (פחות מ- 5% של 22.8 mW) כדי למנוע הלבנת את קרינה פלואורסצנטית ירוק. לאתר את צמתי neuromuscular (אשר נראים כמו חרוזים על חוט) ולרכוש תמונה ברזולוציה נמוכה TIRF. לעבור בו זמנית על 405 ננומטר לייזר (photoconverts mEos2 מירוק מינים אדומים) ו לייזר nm (תמונה mEos2 photoconverted אדום) 561 למקם stochastically חלבונים פלורסנט mEos2 יחיד.הערה: מומלץ השימוש 405 ננומטר לייזר צריכת חשמל נמוכה (0.005% 0.9 4.78 mW) כמו זה מאפשר קצב photoconversion קבועים יחסית במהלך הסרט. שימוש בין 50 ל- 75% ננומטר לייזר 561 (20.1 mW), כמו זה מספיק כדי לרכוש פלורסצנטיות מן המין mEos2 אדום מבלי להשפיע לרעה על המורפולוגיה של רקמות השרירים המקיפים את צומת עצב-שריר. עבור כל שרשרת צומת עצב-שריר, רוכשים פעם סדרה מורכבת של מסגרות 15,000 או יותר ב 33 הרץ. שמור תבנית as.czi על מנת לשמר את המטה-נתונים הנלווה לעיון אפשרי. השתמש ImageJ כדי להמיר קבצי סרט ‘.czi’ ‘.tiff’. לנתח את הסרטים רכשה עם מולקולה בודדת מתאים ומעקב אחר תוכנה אנליטית11,14,36 כגון TrackMate פיג ‘ י/ImageJ37 (ראה טבלה של חומרים). מאתרת את ‘x’ ו- ‘y’ נקודות הציון של כל לוקליזציה מאת התאם גאוסיאני של נקודת העוצמה להפיץ את הפונקציה (PSF).הערה: פתרון בעיות: אם קרינה פלואורסצנטית ירוק לא נצפית או עמום מדי באזור צומת עצב-שריר בתגובה לחשיפה 488 ננומטר לייזר, לעבור בקצרה על לייזרים photoconverting את והדמיה (405 ננומטר ו-561 nm), כמו זה עוזר לייצר יותר של האדום מינים של mEos2. ולאחר מכן לעבור בחזרה אל 488 ננומטר לייזר ולקחת תמונה TIRF. 4. מולקולה בודדת לוקליזציה של הזחלים קבוע כדי למדוד את הגודל nanocluster חלבון באמצעות כף, החלף בינוני חרקים של שניידר לאחר ניתוח עם מקבע – paraformaldehyde 4% מעורבבת עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS). דגירה הזחל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר הקרע פינס ולמקם הזחל קבוע mL 1.7 נקה צינור microcentrifuge snap-lock. לנתח ולפתור כמו רבים הזחלים אחרים לפי הצורך, ואז לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. החלף את PBS בלוק מאגר (פתרון של PBS, 0.1% טריטון X-100 ו- 3% סרום עז נורמלי). לשטוף את הזחלים עם PBS שלוש פעמים ולאחר מכן דגירה עם נוגדן ראשוני הכרחי (מדולל בפתרון מאגר בלוק). דגירה ללון בבית 4 oC. לשטוף את הזחלים 3 פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה עם הנוגדן משניים הדרושים (מדולל בפתרון מאגר בלוק). לשטוף את הזחלים 3 פעמים עם PBS, לצרף הזחל חזרה על בסיס PDMS, ותמונה תיאר כאמור לצורך מעקב מולקולה בודדת.

Representative Results

באמצעות פרוטוקול מהונדס, המפורטים לעיל, Syntaxin-1A-mEos2 Drosophilamelanogaster היו שנוצר (איור 1). הטרנסגניים השלישי instar דרוזופילה הזחלים היו גזור על הבסיס גלילי PDMS (איור 2 א-F). כדי להמחיש מולקולות יחיד של Syntaxin-1A, השתמשנו דקל על מיקרוסקופ TIRF עם תאורה לייזר מעט אלכסונית14. מולקולות יחיד של Syntaxin-1A שהיו תחת מעקב על המסופים presynaptic עצבים מוטוריים על שריר 6 של המקטע השני בטן. ידי קרינה פלואורסצנטית הירוק של mEos2 יכול להתגלות כפי שמוצג בתמונה ברזולוציה נמוכה של Syntaxin-1A-mEos2 על סוג 1b עם העיתון ons כשהוא מתרגש באמצעות 488 ננומטר לייזר (איור 3 א). בניסויים הדמיה, כביש 405 ננומטר, 561 nm עירור לייזר במעמקי הדמיה היו 133.5 nm ו- 165.6 nm, בהתאמה. התמונה ירוק נרכשה כמו ממוצע של 16 מסגרות בודדות. הדימוי הירוק הזה נעשה שימוש כדי ליצור את האזור של ריבית המשמשת להגבלת ניתוח של localizations בסרט photoconverted אל המסופים עצבים מוטוריים presynaptic לבד. הניתוח של סרטים sptPALM photoconverted רכשה שנוצר על עוצמת סופר-נפתרה, מקדם דיפוזיה, וממפה מסלול (איור 3 א). Syntaxin-1A-mEos2 ניידות היה עוד יותר לכמת על ידי ניתוח של העקירה ממוצע הריבועים (MSD) של מסלולים בודדים (איור 3B). השוואות סטטיסטי יכול להיעשות באמצעות השטח מתחת לעקומה MSD (איור 3B). ניתוח נוסף של ניידות מניב התפלגות מקדם דיפוזיה של Syntaxin-1A-mEos2, זה יכול להיות מוערך סטטיסטית על ידי השוואה של הנייד לאוכלוסיות משותק (איור 3C). איור 1 : יצירת מבנים מתויג mEos2. PFL44S-attB-MCS-w + וקטור הוא לליניארית עם BamHI ו- XbaI. קטעים חופפים תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) קידוד החלבון עניין (פוי), mEos2, בהתאמה, יכול להיות משובטים, לדוגמה, ויוו רקומבינציה בתאים שמרים ura3 – או על ידי הרכבה גיבסון. הערה כדי ליצור את transgene Syntaxin-1A-mEos2, שיבטנו הבונה ולצדו יזם Syntaxin-1A אנדוגני של שליחות קטלנית רצפים. הבונה הנוצרת כתוצאה מכך יכול להיות מוזרק לתוך עוברי דרוזופילה כדי ליצור קו לטוס הטרנסגניים לבטא את החלבון עניין (פוי) דבוקה mEos2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : דרוזופילה זחל לנתיחה, תאורה עקיפה. (א) הסכימה מציג ניתוח זחל דרוזופילה בוצעו על בסיס PDMS חצי-גלילי. זחל שפרוסה נערך על גבי PDMS ג’ל על ידי שימוש minutien סיכות. (בג) ההכנות זחל-PDMS הונח בתוך תבשיל שיש תת תרבות חרקים בינוני של שניידר. מיקרוסקופ TIRF בתצורה של תאורה עקיפה מעט שימש להציג באופן חזותי Syntaxin-1A-mEos2 המסופים עצבים מוטוריים. (D-F) בסיס PDMS חצי-גלילי עם זחל דרוזופילה גזור. הכנת זחל-PDMS הונח בתוך צלחת הדמיה מלאה בינוני של שניידר, הזחל צולמה על המיקרוסקופ דקל סופר רזולוציה. סולם בר, 10 מ מ. (איור זה שונה מ-14). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : אין ויוו מעקב Syntaxin-1A-mEos2-presynaptic עצבים מוטוריים מסוף. (א) A ברזולוציה נמוכה TIRF תמונה של Syntaxin-1A-mEos2 על 1b סוג המסוף מנוע עצב. ניתוח של photoconversion סרטים עם תמונה-הרץ 33 שנוצר בעוצמה סופר-נפתרה sptPALM מקדם דיפוזיה, מסלול מפות. מסלולים בודדים 5,309 היו רכישת הסרט יותר מ-16,000 מסגרות תמונה. סולם בר, 3 μm. (בג) ממוצע הריבועים תזוזה (MSD) של Syntaxin-1A-mEos2 סומן מהתחנות עצבים מוטוריים שונים 6; השטח מתחת לעקומה MSD (AUC) נעשה שימוש כדי לכמת את רמת ניידות. התפלגות מקדם דיפוזיה חושף אוכלוסיות Syntaxin-1A ניידים, משותק ניתן לכמת כמו יחסי אחד מהשני; ממוצע של מסלולים ~ 2,400 התקבלו לכל עצבים מוטוריים מסוף (n = 3 הזחלים). הנתונים שהוצגו רשע לשגיאה הסטנדרטית של ממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מולקולה בודדת מעקב של חלבונים מתויג mEos2 בצומת עצב-שריר של הזחל לחלל השלישי דרוזופילה . כדי למנוע ביטוי יתר של חלבון מהונדס, ביטוי Syntaxin-1A-mEos2 היה מונע על ידי יזם Syntaxin-1A אנדוגני. מחקרים של חלבונים סינפטיים ניידות בעיקר היה מוגבל במבחנה לחקירות של תאים בתרבית, נוירונים בקליפת המוח9,11,12,13. אם חלבונים אלה שהפגינו חתימות ניידות דומה-חיים אינו ידוע בעיקר. כדי להמחיש יחיד-חלבון ניידות ויוו, מגבלות כגון שקיפות אופטית, נגישות ועומק חדירה צריך להתגבר. לנתח ההכנה זחל והצגה של צמתי neuromuscular מוטבע על פני השטח של השריר, לנו למנוע את סוגיית אופטי שקיפות ונגישות. ניסיונות התמונה ניידות יחיד-המולקולה בתצורה רגילה של TIRF עלו בתוהו. עם זאת, השימוש תאורה עקיפה מעט מאפשר לייזר עירור מוגברת חודר לעומק. יתר על כן, סיכות minutien להשתמש כדי לשתק את הזחל עזר כדי למנוע כל השפעה שלילית אפשרי השימוש הרדמה על חלבון ניידות. זה אפשרי להשתמש מטרות הגדלה גבוהה יותר, כגון ה-100 x שמן טבילה מטרות, כדי להמחיש מולקולות יחיד בתוך vivo. עם זאת, ההגדלה מוגברת עשוי להגביר את occurance של נשתל בפוקוס. בנוסף, השתמשנו בעוצמה נמוכה יותר (~ 30%) 561 ננומטר לייזר בהצלחה את התמונה מולקולות יחיד-מסופי עצבים מוטוריים. בדיקות נוספות עשויים להידרש לשימוש עוצמת הלייזר נמוך יותר.

פרוטוקול זה מתאים להמחיש את הניידות של חלבונים סינפטיים תוך הקרבה של קרום פלזמה עצביים. באמצעות גישה זו, הניידות של החלבון מוקש – Syntaxin-1A ואת autophagosome מאוגדים חלבון Atg18a – כבר בהצלחה שבעורך vivo בתוך14,26. הניידות של חלבונים על נוירון מוטורי אקסונים ניתן גם חקר27. עם זאת, חקירת הניידות של חלבונים על מוח או בחוט הגחון עצב יכול להתברר כקשה להעריך עקב האות רקע המיוצר על ידי הרקמה הבסיסית; בנוסף, להמחיש חלבון ניידות על מבנה המוח באותו ידרוש fluorescently תיוג את מבנה המוח (כדי לוודא replicability), יהיה צורך להשתמש הדמיה כפולה-מצלמה.

השיטות הקיימות זמינים עבור סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה ב דרוזופילה מוגבלות בעיקר עוברי הדמיה, ולא יותר פיתחו השלישי לחלל זחל38,39. הבעיה העיקרית עם פרוטוקולים אלה היא כי הם תשואה מספר נמוך של מסלולים באזור עם תמונה, ומכאן למנוע ניתוח מעמיק של ניידות הברית22,40. שלנו אין ויוו מולקולה בודדת מעקב פרוטוקול יש את היכולת לייצר מספר רב של מסלולים, ולכן ניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים אחרים כגון Caenorhabiditis elegans דג זברה. אכן, כל שרשרת NMJ שנוצר מסלולים ~ 2,400 שהופך אותו מתאים לניתוח מצבים ניידים שונים של מעברים בין מדינות אלה,14,27. בנוסף, אין ויוו מולקולה בודדת הדמיה אסטרטגיות רבות מסתמכים על השימוש בהרדמה כדי לשתק את חיות20,22, אשר עלולה לשנות את הפונקציה הפיזיולוגיות תחת אשר הסתיימה ההדמיה. כאן אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול “ללא הרדמה” לשתק את הזחלים באמצעות סיכות minutien.

שימוש פוטנציאלי של פרוטוקול זה ייתכן המדגימה את הניידות של חלבונים בשלושה ממדים. התפתחויות אחרונות סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה לאפשר ניידות חלבון מטמיעים במבחנה ב- ‘x’, ‘y’ ו- ‘z’ מידות41,42. השיטה הנוכחית שלנו אינו חשבון לניידות של חלבונים בציר ‘z’. עדיין העצב המוטוריים דרוזופילה מסוף הוא מבנה כדורי, בגישה בעתיד יקר יהיה לכמת חלבון ניידות ב- נפח תלת מימדי43. הדמיה ב z-המימד הוא ריאלי באמצעות עדשת אסטיגמטי. לחלופין, במצב TIRF44,45, z-הרזולוציה הוא גם גדל. עם זאת, בניסויים שלנו, השתמשנו תאורה עקיפה מעט להמחיש מולקולות יחיד של syntaxin1A-mEos2 ללא העדשה אסטיגמטי.

לסיכום, זמינות של שני הטרנסגניים דרוזופילה לטוס מלאי המבטאים חלבונים מתויג עם חלבון photoconvertible, PDMS בסיס לנתח הזחל מהונדס, וכן מיקרוסקופ TIRF מצויד עם האפשרות של שינוי זווית תאורה הם הכלים החשובים ביותר הדרוש כדי להמחיש חלבונים יחיד כפי שמתואר פרוטוקול זה.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ז’אן-בפטיסט Sibarita, דניאל Choquet (IINS, CNRS/אוניברסיטת בורדו) על תמיכתם די עם הניתוח מולקולה בודדת. במיוחד תודה ניק Valmas, ג’סיקה Mcgaw (QBI, אוניברסיטת קווינסלנד) על עזרתם עם הווידאו מקליט, קריינות, כמו גם איור עיצוב גרפי. עבודה זו נתמכה על ידי הפרויקט גילוי המועצה מחקר אוסטרלי (AR) (DP170100125 ל- F.A.M.), המועצה למחקר אוסטרלי (ליף גרנט LE0882864 ל- F.A.M.), מלגת העתיד מועצת המחקר האוסטרלי (גרנט ליף (FT100100725 B.V.S.), LE130100078 כדי F.A.M.) NHMRC הפרוייקט הענק (APP1103923 כדי B.V.S.). F.A.M. הוא עמית מחקר בכיר NHMRC (ONT1060075).

Materials

PDMS (Sylgard 184 silicone elastomer kit) Dow Corning Corporation 000000000001064291
Glass-bottomed Culture Dish In Vitro Scientific D29-20-1.5-N
Optical Stereo-microscope Olympus SZ51
Curved Tweezers (Style 5/45) Electron Microscopy Sciences 0208-5AC-PO
Minutien Pins (0.1mm) Fine Science Tools 26002-10
Schneider's Insect Medium Sigma, Life Sciences S0146
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00
Fine Forceps (Dumont #5) Fine Science Tools 11254-20
ELYRA PS.1 Microscope Zeiss PS.1
Phosphate Buffered Saline (PBS) Lonza 17-515Q
Paraformaldehyde (16%) Electron Microscopy Sciences 15710
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-9284
Normal Goat Serum Sigma-Aldrich G9023
Maxyclear snaplock microcentrifuge Tube (1.7 mL) Axygen MCT-175-C
Zen Black acquisition software Carl Zeiss, 2012
Metamorph software Molecular Devices 7.7.8 PALM Tracer Plugin
Fly strain w1118; HA-Sx1A-mEos2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Sudhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 53 (47), 12696-12717 (2014).
  2. Papadopulos, A., et al. Activity-driven relaxation of the cortical actomyosin II network synchronizes Munc18-1-dependent neurosecretory vesicle docking. Nat Commun. 6, 6297 (2015).
  3. Papadopulos, A., Tomatis, V. M., Kasula, R., Meunier, F. A. The cortical acto-Myosin network: from diffusion barrier to functional gateway in the transport of neurosecretory vesicles to the plasma membrane. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 153 (2013).
  4. Tomatis, V. M., et al. Myosin VI small insert isoform maintains exocytosis by tethering secretory granules to the cortical actin. J Cell Biol. 200 (3), 301-320 (2013).
  5. Wen, P. J., et al. Phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate coordinates actin-mediated mobilization and translocation of secretory vesicles to the plasma membrane of chromaffin cells. Nature Communications. 2, (2011).
  6. Malintan, N. T., et al. Abrogating Munc18-1-SNARE complex interaction has limited impact on exocytosis in PC12 cells. J Biol Chem. 284 (32), 21637-21646 (2009).
  7. Choquet, D., Triller, A. The dynamic synapse. Neuron. 80 (3), 691-703 (2013).
  8. Triller, A., Choquet, D. New concepts in synaptic biology derived from single-molecule imaging. Neuron. 59 (3), 359-374 (2008).
  9. Gandasi, N. R., Barg, S. Contact-induced clustering of syntaxin and munc18 docks secretory granules at the exocytosis site. Nat Commun. 5, 3914 (2014).
  10. Milovanovic, D., Jahn, R. Organization and dynamics of SNARE proteins in the presynaptic membrane. Front Physiol. 6, 89 (2015).
  11. Kasula, R., et al. The Munc18-1 domain 3a hinge-loop controls syntaxin-1A nanodomain assembly and engagement with the SNARE complex during secretory vesicle priming. J Cell Biol. 214 (7), 847-858 (2016).
  12. Constals, A., et al. Glutamate-induced AMPA receptor desensitization increases their mobility and modulates short-term plasticity through unbinding from Stargazin. Neuron. 85 (4), 787-803 (2015).
  13. Ribrault, C., et al. Syntaxin1A lateral diffusion reveals transient and local SNARE interactions. Journal of Neuroscience. 31 (48), 17590-17602 (2011).
  14. Bademosi, A. T., et al. In vivo single-molecule imaging of syntaxin1A reveals polyphosphoinositide- and activity-dependent trapping in presynaptic nanoclusters. Nat Commun. 8, 13660 (2017).
  15. Bar-On, D., et al. Super-resolution imaging reveals the internal architecture of nano-sized syntaxin clusters. J Biol Chem. 287 (32), 27158-27167 (2012).
  16. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  17. Zhang, M. S., et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (7), 727-U297 (2012).
  18. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  19. Schneider, R., et al. Mobility of calcium channels in the presynaptic membrane. Neuron. 86 (3), 672-679 (2015).
  20. Berning, S., Willig, K. I., Steffens, H., Dibaj, P., Hell, S. W. Nanoscopy in a living mouse brain. Science. 335 (6068), 551-551 (2012).
  21. Willig, K. I., et al. Nanoscopy of filamentous actin in cortical dendrites of a living mouse. Biophys J. 106 (1), L01-L03 (2014).
  22. Zhan, H., et al. In vivo single-molecule imaging identifies altered dynamics of calcium channels in dystrophin-mutant C. elegans. Nat Commun. 5, 4974 (2014).
  23. Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-220 (2008).
  25. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  26. Vanhauwaert, R., et al. The SAC1 domain in synaptojanin is required for autophagosome maturation at presynaptic terminals. EMBO J. , (2017).
  27. Joensuu, M., et al. Subdiffractional tracking of internalized molecules reveals heterogeneous motion states of synaptic vesicles. J Cell Biol. 215 (2), 277-292 (2016).
  28. Merhi, A., Gerard, N., Lauwers, E., Prevost, M., Andre, B. Systematic mutational analysis of the intracellular regions of yeast Gap1 permease. PLoS One. 6 (4), e18457 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  30. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  31. Stewart, B. A., McLean, J. R. Population density regulates Drosophila synaptic morphology in a Fasciclin-II-dependent manner. J Neurobiol. 61 (3), 392-399 (2004).
  32. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
  33. Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J Neurophysiol. 88 (5), 2659-2663 (2002).
  34. Halachmi, N., Nachman, A., Salzberg, A. Visualization of proprioceptors in Drosophila larvae and pupae. J Vis Exp. (64), e3846 (2012).
  35. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  36. Nair, D., et al. Super-resolution imaging reveals that AMPA receptors inside synapses are dynamically organized in nanodomains regulated by PSD95. J Neurosci. 33 (32), 13204-13224 (2013).
  37. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  38. Ferguson, J. P., et al. Deciphering dynamics of clathrin-mediated endocytosis in a living organism. J Cell Biol. 214 (3), 347-358 (2016).
  39. Greiss, F., Deligiannaki, M., Jung, C., Gaul, U., Braun, D. Single-Molecule Imaging in Living Drosophila Embryos with Reflected Light-Sheet Microscopy. Biophys J. 110 (4), 939-946 (2016).
  40. Robin, F. B., McFadden, W. M., Yao, B., Munro, E. M. Single-molecule analysis of cell surface dynamics in Caenorhabditis elegans embryos. Nat Methods. 11 (6), 677-682 (2014).
  41. Singh, A. P., et al. 3D Protein Dynamics in the Cell Nucleus. Biophys J. 112 (1), 133-142 (2017).
  42. Perillo, E. P., et al. Deep and high-resolution three-dimensional tracking of single particles using nonlinear and multiplexed illumination. Nat Commun. 6, 7874 (2015).
  43. Knodel, M. M., et al. Synaptic bouton properties are tuned to best fit the prevailing firing pattern. Front Comput Neurosci. 8, 101 (2014).
  44. Yang, Q., Karpikov, A., Toomre, D., Duncan, J. Estimation of 3D geometry of microtubules using multi-angle total internal reflection fluorescence microscopy. Med Image Comput Comput Assist Interv. 13 (Pt 2), 538-545 (2010).
  45. Boulanger, J., et al. Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (48), 17164-17169 (2014).

Tags

Single-molecule TrackingDrosophilaPresynaptic Motor Nerve TerminalIn VivoPhotoconvertible FluorophoreSchneider’s Insect MediumDissectionSylgard BaseTIRF MicroscopyNeuromuscular Junctions

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Bademosi, A. T., Lauwers, E., Amor, R., Verstreken, P., van Swinderen, B., Meunier, F. A. In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal. J. Vis. Exp. (131), e56952, doi:10.3791/56952 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image