在体内果蝇前运动神经末端的单分子跟踪

1. 转基因果蝇表达 mEos2-Tagged 蛋白的设计 选择要用 mEos2 蛋白标记的蛋白质。为了提高成像成功率, 在神经元等离子膜中选择具有跨膜域的蛋白质14 (例如、Syntaxin-1A)、突触泡上的蛋白质或体26、27 (如Synaptobrevin-2), 或胞浆蛋白与神经元细胞膜蛋白 (例如, Munc18-1) 密切互动。 构造转基因编码 mEos2-tagged 蛋白 (图 1)。设计了蛋白质和 mEos2 的正反引物。注意: mEos2 编码序列可以从 pmEos2-N1 质粒中放大, 这是为了融合到感兴趣的蛋白质的 c-末端。例如, 克隆可以通过在体内重组在酿酒酵母中使用 pFL44S-attB-MCS-w+ 向量14,28, 交替使用其他克隆方法, 如吉布森程序集协议29。 线性将 BamHI 和 XbaI 和 co-transform 的向量与ura3-酵母细胞结合, 并结合 PCR 片段编码 mEos2 和感兴趣的蛋白质。注入果蝇胚胎与构造生成一个转基因飞线30。 在标准酵母和糖蜜培养基上或在塑料瓶中含有的其他合适的替代品后, 将转基因果蝇培养起来。为了确保健康和相当大的突触 boutons31, 避免在小瓶中过度拥挤, 并在每天产卵后将苍蝇翻转到新的瓶子里;这可确保第三龄幼虫在开始在培养基上游荡时, 能很好地喂养并达到适当的大小。在室温下提高转基因蝇 (25 ° c)。注: 较大的突触 boutons 倾向于在成像过程中产生更大数量的可视化蛋白质。 2. 第三龄幼虫解剖 使用合适的硅胶弹性体套件 (图 2A), 使直径为≤20毫米的圆柱形或半圆形型烷 (聚硅氧烷) 底座和≤20 mm 的高度。混合硅酮弹性体与硅硬化剂的比例为10:1。 将混合物彻底搅拌5分钟, 将混合物倒入模具中, 上面列出的 dimsensions。让它在烤箱硬化在100° c 为45分钟。该基地将作为进行解剖的基础。确保与玻璃底培养皿的井相配合。 从小瓶壁上选择一个游荡的第三龄幼虫。使用光学立体显微镜在4.5 倍放大, 以可视化的幼虫放置在与背面的硅橡胶圆柱形基地。 使用弯曲和角度的镊子, 坚持 minutien 针头上的嘴钩, 两个延长前气孔之间, 并在尾部的肛门, 两个后气孔。在室温下将施耐德的昆虫培养基加40µL 到固定的幼虫上。注意: Hemolyph 类似的解决方案 (HL3 或 HL6) 也可以在施耐德的解决方案3233的位置使用。 通过使用 minutien 针将幼虫腹壁的背侧切开进入壁的中线。 使用弹簧剪刀从切口点切开身体壁。沿中线在前面后方方向切开34。 用细钳和弹簧剪刀破幼虫: 去除内脏, 包括唾液腺、气管和内脏。用施耐德的昆虫培养基冲洗两次幼虫。 用细钳, 按住两个身体壁襟翼, 轻轻地伸展出来, 并坚持两个 minutien 针两侧。这将产生一个六边形形状的准备 (图 2A)。 用弹簧剪刀将大脑从腹侧神经线上分离出来, 以减少成像过程中肌肉运动的可能性;这也有助于保持准备单位对成像盘。使用弯曲的镊子将所有六 minutien 引脚推入到该基地。注: 只有一小部分的引脚应嵌入在腹壁内。 为了证实幼虫在解剖过程中幸存下来, 轻微地戳腹神经线, 这应该引出幼虫腹壁的蠕动收缩。 3. 微斜光照单粒子跟踪显微镜 将被解剖的幼虫–硅橡胶底座倒置到玻璃底的培养皿中。用2毫升室温施耐德的昆虫培养基填充成像盘 (图 2B)。 使用 63 x/1.2 NA 浸水目标在荧光全内反射荧光 (TIRF) 显微镜下, 在腹部肌肉6和 735中找到第二和第三段的运动神经元。 使用显微镜的目镜定位解剖幼虫;使用明亮的磁场照明识别肌肉6。 使用显微镜采集软件 (参见材料表), TIRF 配置;将准直摄像机的角度滑动至°, 增加穿透深度, 否则 TIRF 临界角移出以达到斜向照明。 开关 488 nm 激光, 以可视化 mEos2 在绿色。使用低激光功率 (少于5% 的22.8 兆瓦), 以避免漂白绿色荧光。找到神经肌肉结 (看起来像一个字符串上的珠子), 并获得低分辨率 TIRF 图像。 同时开关 405 nm 激光 (photoconverts mEos2 从绿色到红色物种) 和 561 nm 激光 (图像 photoconverted 红色 mEos2) 随机定位单一 mEos2 荧光蛋白。注: 建议使用低 405 nm 激光功率 (0.005 到0.9% 的4.78 兆瓦), 因为这允许在电影采集期间相对恒定的 photoconversion 率。使用50和75% 的 561 nm 激光 (20.1 兆瓦), 因为这是足以获得荧光从红 mEos2 物种, 而不影响肌肉组织的形态学周围的神经肌肉结。 对于每个神经肌肉结链, 获得一个时间序列由1.5万帧或更多的33赫兹. 保存为. czi 格式, 以保留所附的元数据以供可能参考。 使用 ImageJ 将 “. czi” 电影文件转换为 “. tiff” 文件。 用合适的分子跟踪分析软件分析获得的电影11,14,36 , 如 TrackMate 在斐济/ImageJ37 (参见材料表)。通过灰度点扩展函数的高斯拟合, 定位每个定位的 “x” 和 “y” 坐标。注:疑难解答: 如果在接触 488 nm 激光时未观察到绿色荧光或在神经肌肉接合处太暗, 则简要切换 photoconverting 和成像激光器 (405 nm 和 561 nm), 因为这有助于产生更多的红色mEos2 的种类。然后切换回 488 nm 激光器, 并采取 TIRF 图像。 4. 固定幼虫的单分子定位 通过手掌来测量蛋白质簇的大小, 在解剖后用固定剂-4% 甲醛稀释磷酸盐缓冲盐 (PBS) 取代施耐德的昆虫培养基。 在室温下孵育幼虫30分钟。 取出解剖针脚, 并将固定的幼虫放在1.7 毫升的透明锁离心管中。 根据需要解剖和修复其他许多幼虫, 然后用 PBS 冲洗三次。 将 pbs 替换为块缓冲 (pbs、0.1% 卫 X-100 和3% 正常山羊血清的溶液)。 用 PBS 三次冲洗幼虫, 然后用必要的主抗体 (在块缓冲液中稀释) 进行孵育。 在 4 oC 夜间孵育。 用 PBS 洗涤幼虫三次, 然后用必要的二级抗体孵育 (稀释在块缓冲液中)。 用 PBS 清洗幼虫三次, 将幼虫附着在其上, 并像先前描述的分子跟踪一样。