Celle aggregering analyser evaluere bindingen Drosophila hakket med Trans-ligander og dens hemming av Cis-ligander
Summary
Kompleksiteten i vivo systemer gjør det vanskelig å skille mellom aktivering og hemming hakk reseptoren av trans– og cis-ligander, henholdsvis. Her presenterer vi en protokoll basert på i vitro celle-aggregering analyser for kvalitativ og kvantitativ semi evaluering av binding av Drosophila hakk til trans-ligander vs cis-ligander.
Abstract
Hakk signalnettverk er et evolusjonært bevarte celle-celle kommunikasjonssystem brukes bredt i animalske utvikling og voksen vedlikehold. Samspillet av hakk reseptoren med ligander fra nabokommunene cellene induserer aktivering av signalveien (trans-aktivisering), mens interaksjon med ligander fra samme celle hemmer signalering (cis-hemming). Riktig balanse mellom trans-aktivering og cis-hemming bidrar til å etablere optimale nivåer av hakk signalering i noen sammenhenger under utviklingen av dyr. På grunn av overlappende uttrykk domenene hakk og dens ligander i mange celletyper og eksistensen av tilbakemelding mekanismer, studerer effekten av en gitt post-translasjonell modifikasjon på trans– versus cis-interaksjoner av hakk og sin ligander i vivo er vanskelig. Her beskriver vi en protokoll for bruk Drosophila S2 celler i celle-aggregering analyser for å vurdere effekten av banket ned et hakk veien modifikator på binding av hakk for hver ligand trans og cis. S2 celler stabilt eller transiently transfekterte med et hakk-uttrykke vektor er blandet med celler som uttrykker hvert hakk ligand (S2-Delta eller S2-Serrate). Trans-bindingen mellom reseptor og ligander resulterer i dannelsen av heterotypic celle aggregater og måles i antall aggregater per mL består av > 6 celler. Undersøke den hemmende effekten av cis-ligander, S2 celler uttrykke co hakk og hver ligand er blandet med S2-Delta eller S2-Serrate og antall aggregater er kvantifisert som beskrevet ovenfor. Relative reduksjonen i antall aggregater av cis-ligander gir et mål på cis-ligand-mediert hemming av trans-binding. Disse enkle analyser kan gi semi kvantitative data om virkningene av genetiske eller farmakologiske manipulasjoner på bindingen av hakk til sin ligander, og kan bidra til å tyde de molekylære mekanismene underliggende i vivo virkningene av slike manipulasjoner i hakk signalering.
Introduction
Kanoniske hakk signalnettverk er en kort rekkevidde celle til celle kommunikasjon mekanisme som krever fysisk kontakt i nabolandet celler for å gjøre interaksjon mellom hakk reseptorer og deres ligander1. Samspillet av hakk reseptor (finnes på overflaten av signal-mottak celler) med ligander (på overflaten av signal-sende celler) starter hakk signalering og er kjent som trans-aktivisering2. På den annen side, samspillet mellom hakk og dens ligander i samme celle fører til hemming av hakk veien og er kjent som cis-hemming3. Balansen mellom trans– og cis-interaksjoner er nødvendig for å sikre optimal ligand-avhengige hakk signalering4. Drosophila har ett hakk reseptoren og to ligander (Delta og Serrate) i motsetning til pattedyr, som har fire hakk reseptorer og fem ligander [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-lignende 1 (DLL1), DLL3 og DLL4]5. Har dette enkelhet, gir Drosophila modellen enkel å dissekere/studie effekten av veien modifikatorer hakk-ligand interaksjoner og senere på hakk signalering. I enkelte sammenhenger under dyr utvikling (inkludert fløyen utvikling i Drosophila), både cis– og trans-interaksjoner er involvert for å oppnå riktig hakk signalering og celle skjebne1,6 . Det er viktig å skille effekten av hakk veien modifikatorer i disse sammenhenger på cis– versus trans-interaksjoner av hakk med sin ligander.
Vår gruppe tidligere rapportert at tillegg av et karbohydrat rester kalt xylose til Drosophila hakk negativt regulerer hakk signalering i visse sammenhenger, inkludert fløyen utvikling7. Tap av shams (enzymet som xylosylates hakk) fører til en “tap av vingen venen” fenotypen7. Nylig ble genet dosering eksperimenter og klonal analyse brukt til å vise at tap av shams forbedrer Delta-mediert hakk singling. Å skille om den forbedrede hakk signalering i shams mutanter er et resultat av redusert cis-hemming eller økt trans-aktivisering, ektopisk overuttrykte studier av hakk ligander i larver fløyen imaginal plater med dpp-GAL4 driveren ble utført. Disse eksperimentene gitt bevis antyder at Shams regulerer trans-aktivering av hakk ved å Delta uten å påvirke hakk cis-hemming av ligander8. Imidlertid, mate-rygg forskrifter og virkningene av endogene ligander kan komplisere tolkningen av ektopisk overuttrykte studier1,6,9.
Du løser dette problemet, Drosophila S2 celler10 ble brukt, som gir en enkel i vitro system for hakk-ligand samhandling studier11,12. S2 celler ikke uttrykke endogene hakk reseptor og Delta ligand11 og uttrykke lave Serrate13, hvilke ikke påvirker hakk-ligand aggregering eksperimenter8. Derfor kan S2 celler være stabilt eller transiently transfected hakk og/eller personlige ligander (Delta eller Serrate) for å generere celler som uttrykker utelukkende hakk reseptoren eller en av dens ligander eller en kombinasjon. Blanding av hakket-uttrykke S2 celler med ligand-uttrykke S2 celler resultater i dannelsen av heterotypic aggregater formidlet av reseptor-ligand binding11,12,14. Kvantifisering av samlet formasjonen gir et mål på trans-binding mellom hakk og dens ligander15 (figur 1). Tilsvarende S2 celler kan co transfekterte med hakk og Delta eller Serrate ligander (i.e. cis-ligander). CIS-ligander i disse hakk-uttrykke S2 cellene oppheve binding av hakk med trans-ligander og resultere i redusert samlede formasjon8,12,14. Relativ nedgangen i samlet dannelse forårsaket av cis-ligander gir et mål på den hemmende effekten av cis-ligander bindingen mellom hakk og trans-ligander (figur 2). Følgelig celle aggregering analyser ble brukt for å undersøke effekten av tap av xylosylation på trans– og cis-interaksjoner mellom hakk og dens ligander.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for cellen aggregering analyser rettet å evaluere binding av hakk med trans-ligander og dens hemming av cis-ligander bruke Drosophila S2 celler. Som et eksempel, tilbyr vi data som tillot oss å fastslå effekten av hakk xylosylation bindingen mellom hakk og trans-deltaet8. Disse enkle analyser gir en semi kvantitativ vurdering av hakk-ligand interaksjoner i vitro og avgjøre molekylære mekanismer underliggende i vivo effekten av hakk veien modifikatorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanoniske hakk signalering, avhenger av samspillet mellom hakk reseptoren og dens ligander5. Selv om de fleste studier hakk veien vurdere primært binding av hakk og ligander i nærliggende celler (trans), samhandler hakk og samme celle ligander, og disse såkalte cis-interaksjoner kan spille en hemmende rolle i hakk signalering3,4. Følgelig dechiffrere mekanismene bak effekten av en modifikator på kanonisk hakk signale…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter støtte fra NIH/NIGMS (R01GM084135 til HJN) og Mizutani grunnlag for Glycoscience (grant #110071 til HJN), og er takknemlige for Tom V. Lee for diskusjoner og forslag på analyser, og Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine og Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) for plasmider og linjer.
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
Referencias
- de Celis, J. F., Bray, S., Garcia-Bellido, A. Notch signalling regulates veinlet expression and establishes boundaries between veins and interveins in the Drosophila wing. Development. 124 (10), 1919-1928 (1997).
- Fortini, M. E. Notch signaling: the core pathway and its posttranslational regulation. Dev Cell. 16 (5), 633-647 (2009).
- del Alamo, D., Rouault, H., Schweisguth, F. Mechanism and significance of cis-inhibition in Notch signalling. Curr Biol. 21 (1), R40-R47 (2011).
- Sprinzak, D., et al. Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465 (7294), 86-90 (2010).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Huppert, S. S., Jacobsen, T. L., Muskavitch, M. A. Feedback regulation is central to Delta-Notch signalling required for Drosophila wing vein morphogenesis. Development. 124 (17), 3283-3291 (1997).
- Lee, T. V., et al. Negative regulation of notch signaling by xylose. PLoS Genet. 9 (6), e1003547 (2013).
- Lee, T. V., Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Xylosylation of the Notch receptor preserves the balance between its activation by trans-Delta and inhibition by cis-ligands in Drosophila. PLoS Genet. 13 (4), e1006723 (2017).
- Jacobsen, T. L., Brennan, K., Arias, A. M., Muskavitch, M. A. Cis-interactions between Delta and Notch modulate neurogenic signalling in Drosophila. Development. 125 (22), 4531-4540 (1998).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27 (2), 353-365 (1972).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Fleming, R. J., et al. An extracellular region of Serrate is essential for ligand-induced cis-inhibition of Notch signaling. Development. 140 (9), 2039-2049 (2013).
- Saj, A., et al. A combined ex vivo and in vivo RNAi screen for notch regulators in Drosophila reveals an extensive notch interaction network. Dev Cell. 18 (5), 862-876 (2010).
- Fiuza, U. M., Klein, T., Martinez Arias, A., Hayward, P. Mechanisms of ligand-mediated inhibition in Notch signaling activity in Drosophila. Dev Dyn. 239 (3), 798-805 (2010).
- Ahimou, F., Mok, L. P., Bardot, B., Wesley, C. The adhesion force of Notch with Delta and the rate of Notch signaling. J Cell Biol. 167 (6), 1217-1229 (2004).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Okajima, T., Xu, A., Irvine, K. D. Modulation of notch-ligand binding by protein O-fucosyltransferase 1 and fringe. J Biol Chem. 278 (43), 42340-42345 (2003).
- Acar, M., et al. Rumi is a CAP10 domain glycosyltransferase that modifies Notch and is required for Notch signaling. Cell. 132 (2), 247-258 (2008).
- Bruckner, K., Perez, L., Clausen, H., Cohen, S. Glycosyltransferase activity of Fringe modulates Notch-Delta interactions. Nature. 406 (6794), 411-415 (2000).
- Yamamoto, S., et al. A mutation in EGF repeat-8 of Notch discriminates between Serrate/Jagged and Delta family ligands. Science. 338 (6111), 1229-1232 (2012).
