सेल एकत्रीकरण परख सीआईएसद्वारा ट्रांस-लाइगैंडों और उसके निषेध के साथ Drosophila पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के लिए-लाइगैंडों
Summary
वीवो सिस्टम में की जटिलता यह मुश्किल ट्रांसऔर सीआईएस-लाइगैंडों, क्रमश: से सक्रियकरण और पायदान रिसेप्टर के निषेध के बीच अंतर करने के लिए बनाता है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल के आधार पर प्रस्तुत इन विट्रो सेल- Drosophila पायदान की बाध्यकारी गुणात्मक और अर्द्ध मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए ट्रांस-लाइगैंडों बनाम सीआईएस-लाइगैंडों के लिए एकत्रीकरण परख ।
Abstract
पायदान संकेतन एक evolutionarily संरक्षित सेल सेल संचार प्रणाली पशु विकास और वयस्क रखरखाव में मोटे तौर पर इस्तेमाल किया है । पड़ोसी कोशिकाओं से लाइगैंडों के साथ पायदान रिसेप्टर की बातचीत संकेतन मार्ग (ट्रांस-सक्रियण) के सक्रियण लाती है, जबकि एक ही सेल से लाइगैंडों के साथ बातचीत संकेत (सीआईएस-निषेध) रोकता है । ट्रांससक्रियकरण और सीआईएसके बीच उचित संतुलन-निषेध पशु विकास के दौरान कुछ संदर्भों में संकेत पायदान के इष्टतम स्तर की स्थापना में मदद करता है । क्योंकि पायदान के अतिव्यापी अभिव्यक्ति डोमेन और उसके लाइगैंडों कई प्रकार के सेल और प्रतिक्रिया तंत्र के अस्तित्व में, ट्रांसपर दिया पोस्ट-अनुवाद संशोधन के प्रभाव का अध्ययन बनाम सीआईएस-पायदान की बातचीत और vivo में इसकी लाइगैंडों मुश्किल है. यहां, हम सेल में Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन-एकत्रीकरण परख ट्रांस में और सीआईएसमें प्रत्येक ligand को पायदान के बंधन पर एक पायदान मार्ग संशोधक नीचे दस्तक के प्रभाव का आकलन । s2 के एक पायदान-व्यक्त वेक्टर के साथ छुरा या क्षणिक transfected कोशिकाओं को प्रत्येक पायदान ligand (s2-डेल्टा या s2-दांतेदार) व्यक्त कक्षों के साथ मिश्रित कर रहे हैं । heterotypic कोशिका समुच्चय के गठन में रिसेप्टर और लाइगैंडों परिणामों के बीच ट्रांसबंधन और & #62 की रचना प्रति मिलीलीटर की संख्या के संदर्भ में मापा जाता है, 6 कोशिकाओं. सीआईएस-लाइगैंडों के निरोधात्मक प्रभाव की जांच करने के लिए, s2 कोशिकाओं सह व्यक्त पायदान और प्रत्येक ligand s2-डेल्टा या s2-दांतेदार कोशिकाओं के साथ मिश्रित कर रहे हैं और समुच्चय की संख्या के रूप में ऊपर वर्णित मात्रा है । सीआईएसकी उपस्थिति के कारण समुच्चय की संख्या में रिश्तेदार कमी-लाइगैंडों ट्रांस-बाध्यकारी के सीआईएस-ligand-मध्यस्थता निषेध का एक उपाय प्रदान करता है । ये सरल परख अर्द्ध अपने लाइगैंडों को पायदान की बाध्यकारी पर आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ के प्रभाव पर मात्रात्मक डेटा प्रदान कर सकते हैं, और आणविक प्रभाव में vivo अंतर्निहित तंत्र को समझने में मदद कर सकते है पायदान संकेतन पर इस तरह जोड़तोड़ ।
Introduction
विहित पायदान संकेतन सेल संचार तंत्र है कि पायदान रिसेप्टर्स और उनके लाइगैंडों1के बीच बातचीत की सुविधा के लिए पड़ोसी कोशिकाओं के शारीरिक संपर्क की आवश्यकता के लिए एक छोटी दूरी सेल है । पायदान रिसेप्टर की बातचीत (संकेत प्राप्त कोशिकाओं की सतह पर मौजूद) लाइगैंडों के साथ (संकेत-भेजने की सतह पर मौजूद) पायदान संकेतन शुरू होता है और ट्रांससक्रियण2के रूप में जाना जाता है. दूसरी ओर, पायदान और एक ही सेल में अपने लाइगैंडों के बीच बातचीत पायदान मार्ग के निषेध की ओर जाता है और सीआईएस-संकोच3के रूप में जाना जाता है । ट्रांसऔर सीआईएसके बीच संतुलन-बातचीत इष्टतम ligand-निर्भर पायदान संकेतन4सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । Drosophila एक पायदान रिसेप्टर और दो लाइगैंडों (डेल्टा और दांतेदार) के रूप में स्तनधारी है, जो चार पायदान रिसेप्टर्स और पांच लाइगैंडों [दांतेदार 1 (JAG1), JAG2, डेल्टा की तरह 1 (DLL1), DLL3 और DLL4 है विरोध किया है]5। इस सादगी होने, Drosophila मॉडल पायदान ligand बातचीत पर मार्ग संशोधक के प्रभाव और बाद में पायदान संकेतन पर टुकड़े/अध्ययन करने के लिए आसानी प्रदान करता है । पशु विकास के दौरान कुछ संदर्भों में ( Drosophilaमें विंग विकास सहित), दोनों सीआईएसऔर ट्रांस-बातचीत उचित पायदान संकेतन और सेल भाग्य1प्राप्त करने के लिए शामिल हैं,6 . यह सीआईएसबनाम ट्रांसअपने लाइगैंडों के साथ पायदान की बातचीत पर इन संदर्भों में पायदान मार्ग संशोधक के प्रभाव को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
हमारे समूह पहले की सूचना दी है कि एक कार्बोहाइड्रेट अवशेषों के अलावा xylose बुलाया Drosophila पायदान नकारात्मक कुछ संदर्भों, विंग विकास7सहित में संकेतन पायदान नियंत्रित करता है । शम्स की हानि (एंजाइम कि xylosylates पायदान) पंख नस की एक “हानि” phenotype7की ओर जाता है । हाल ही में, जीन खुराक प्रयोगों और क्लोनल विश्लेषण को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि शम्स की हानि डेल्टा-मध्यस्थता पायदान singling को बढ़ाता है. अंतर करने के लिए कि क्या शम्स म्यूटेंट में बढ़ाया पायदान संकेत कम सीआईएस-निषेध या वृद्धि हुई ट्रांस-सक्रियण, लार्वा विंग काल्पनिक डिस्क में पायदान लाइगैंडों के अस्थानिक एक्सप्रेस अध्ययन का परिणाम है का उपयोग करते हुए डीपीपी-GAL4 ड्राइवर प्रदर्शन किया गया । इन प्रयोगों से पता चलता है कि शम्स लाइगैंडों8द्वारा पायदान सीआईएस-निषेध को प्रभावित किए बिना डेल्टा द्वारा पायदान के पार-सक्रियण नियंत्रित करता है सबूत प्रदान की है । हालांकि, फ़ीड वापस नियमों और अंतर्जात लाइगैंडों के प्रभाव अस्थानिक की व्याख्या को जटिल हो सकता है अध्ययन1,6,9।
इस समस्या को हल करने के लिए, Drosophila S2 कोशिकाओं10 उपयोग किया गया है, जो पायदान के लिए एक सरल इन विट्रो प्रणाली प्रदान-ligand बातचीत अध्ययन11,12. S2 कोशिकाओं अंतर्जात पायदान रिसेप्टर और डेल्टा ligand11 व्यक्त नहीं करते हैं और दांतेदार13, जो पायदान-ligand एकत्रीकरण प्रयोगों8को प्रभावित नहीं करता है की एक निम्न स्तर व्यक्त करते हैं. इसलिए, S2 कोशिकाओं वार या क्षणिक transfected पायदान और/या व्यक्तिगत लाइगैंडों (डेल्टा या दांतेदार) द्वारा किया जा सकता है कि विशेष रूप से पायदान रिसेप्टर या इसके लाइगैंडों, या उनमें से एक संयोजन व्यक्त कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए. ligand-एक्सप्रेस s2 कोशिकाओं heterotypic रिसेप्टर-ligand बाध्यकारी11,12,14द्वारा मध्यस्थता समुच्चय के गठन में परिणाम के साथ पायदान-एक्सप्रेस s2 कोशिकाओं के मिश्रण । समग्र गठन के ठहराव पायदान और उसके लाइगैंडों15 (चित्रा 1) के बीच ट्रांसबाध्यकारी का एक उपाय प्रदान करता है । इसी तरह, S2 कोशिकाओं पायदान और डेल्टा या दांतेदार लाइगैंडों (यानी सीआईएस-लाइगैंडों) के साथ सह transfected जा सकता है । सीआईएस-लाइगैंडों इन पायदान-एक्सप्रेस S2 कोशिकाओं में ट्रांस-लाइगैंडों के साथ पायदान के बंधन को निराकृतकरतेहैं और परिणाम में घटी कुल गठन8,12,14। सीआईएसकी वजह से कुल गठन में सापेक्ष कमी-लाइगैंडों पायदान और ट्रांस-लाइगैंडों (चित्रा 2) के बीच बाध्यकारी पर सीआईएसलाइगैंडों के निरोधात्मक प्रभाव का एक उपाय प्रदान करता है । तदनुसार, सेल एकत्रीकरण परख ट्रांसऔर सीआईएस-पायदान और उसके लाइगैंडों के बीच बातचीत पर xylosylation के नुकसान के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयोग किया गया ।
यहाँ, हम Drosophila S2 कोशिकाओं का उपयोग करके ट्रांस-लाइगैंडों और इसके निषेध द्वारा सीआईएसलाइगैंडों के साथ पायदान के बंधन का मूल्यांकन करने के उद्देश्य से सेल एकत्रीकरण परख के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक उदाहरण के रूप में, हम पायदान और ट्रांसडेल्टा8के बीच बाध्यकारी पर पायदान xylosylation के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए हमें अनुमति दी है कि डेटा प्रदान करते हैं । ये सरल परख पायदान के एक अर्द्ध मात्रात्मक आकलन प्रदान-ligand इन विट्रो में बातचीत और मदद आणविक पायदान मार्ग संशोधक के vivo में प्रभाव अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
विहित पायदान संकेतन पायदान रिसेप्टर और उसके लाइगैंडों5के बीच बातचीत पर निर्भर करता है । हालांकि पायदान मार्ग पर सबसे अधिक अध्ययन मुख्यतः पायदान और पड़ोसी कोशिकाओं (ट्रांस), पायदान और एक ह?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक NIH/NIGMS (R01GM084135 to HJN) और Mizutani फाउंडेशन फॉर Glycoscience (ग्रांट #110071 टू HJN) से समर्थन स्वीकार करते हैं, और परख पर विचार विमर्श और सुझावों के लिए टॉम वी. ली के आभारी हैं, और Spyros Artavanis-Tsakonas, ह्यूगो Bellen, रॉबर्ट फ्लेमिंग, केन इर्विन और plasmids और सेल लाइंस के लिए Drosophila जीनोमिक्स रिसोर्स सेंटर (DGRC) ।
Materials
| BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified | Lonza | 04-351Q | |
| HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution | GE Healthcare lifescience | SV30010 | |
| CELLSTAR 6 well plate | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| CELLSTAR 24 well plate | Greiner Bio-One | 662160 | |
| VWR mini shaker | Marshell Sceintific | 12520-956 | |
| Hemocytometer | Fisher Sceintific | 267110 | |
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| MEGAscrip T7 Transcription Kit | Ambion | AM1334 | |
| Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) | Zymo Research | R1054 | |
| VistaVision Inverted microscope | VWR | ||
| 9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software | AmScope | MU-900 | Image acquisition using ToupView software |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| Fetal Bovine Serum | GenDepot | F0600-050 | |
| Methotrexate | Sigma-Aldrich | A6770-10 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | HY068-L6 | |
| Copper sulphate | Macron Fine Chemicals | 4448-02 | |
| S2 cells | Invitrogen | R69007 | |
| S2-SerrateTom cells | Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013) | ||
| S2-Delta cells | DGRC | 152 | |
| S2-Notch cells | DGRC | 154 | |
| pMT-Delta vector | DGRC | 1021 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pMT-Serrate vector | Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003) | ||
| pMT-Notch vector | DGRC | 1022 | Gift from S. Artavanis-Tsakonas |
| pAc5.1-EGFP | Gift from Hugo Bellen | ||
| TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystem | 1611091 | |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) | Applied Biosystem | Dm02144576_g1 | with FAM-MGB dye |
| TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) | Applied Biosystem | Dm02151827_g1 | with FAM-MGB dye |
| Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystem | 4351405 | 96-well Block module |
Referencias
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