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Medicina

혈소판 수혈에 미에 대 한 메서드를 검사 하는 루틴

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56893
, , ,
1Research & Development,LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory,LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research,University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

Summary

혈소판 집중에서 microparticle 콘텐츠 심사에 따라 혈소판 재고 관리 병원 혈액 은행에 새로운 품질 개선 이니셔티브 이다. 활성화 된 혈소판의 사용을 최적화 하기 위해 비 활성화 된 혈소판에서 차별화 하는 목표가입니다. 혈액 종양 환자에 게 제공 하는 비 활성화 된 혈소판 내 화 될 그들의 높은 위험이 줄어들 수 있습니다.

Abstract

혈소판 집중에서 microparticle 콘텐츠 심사에 따라 혈소판 재고 관리 병원 혈액 은행에 대 한 새로운 품질 개선 이니셔티브 이다. 셀 미 (MP) 때 그들은 스트레스에서 조각입니다. 혈액과 혈액 구성 세포, 가장 주목할만 하 게 활성화 된 혈소판의 다양 한에서 세포 조각을 포함할 수 있습니다. 응고에 hemostasis 타고 난 면역 세포 및 주요 선수로 그들의 역할을 수행할 때 혈소판 모양을 변경 하 고 미를 생성 합니다. 동적 산란 (DL) 함께-microparticle 탐지를 기반으로 그것은 비 활성화 (낮은 microparticle) 혈소판 수혈에서에서 활성화 (높은 microparticle)를 구분 하 여이 부족 한 혈액 제품의 사용을 최적화. 이전 연구는 내 화 되 고의 위험을 줄일 하 고 환자 치료를 개선 수 혈액 종양 환자에서 예방 사용에 대 한 비 활성화 된 혈소판을 제공 하 나왔다. 이 검사 방법의 목표는 정기적으로 차별화 하는 비 활성화 된 혈소판에서 활성화. 여기 설명 하는 방법을 설명 병원 혈액 은행에서 일상적인 혈소판 재고 관리에 대 한 수행 하는 단계: 테스트를 수행 하는 DL DL 측정 모 세관으로 샘플을 로드 혈소판 수혈에서 샘플을 얻기 미, 및 활성화 된 혈소판을 식별 보고 microparticle 콘텐츠를 사용 하 여 식별 합니다.

Introduction

미에 관심은 주로 셀을 셀 통신 및 생물 학적 과정에 그들의 참여 주위 revolved 있다. 1 , 2 , 3 최근 미 또한 받고 있다 관심 자가 면역 및 심혈 관 질환의 잠재적인 조기 진단 마커로. 4 , 5 미로 알려진 또한 extracellular 소포 또는 exosomes는 널리 조사 cytometry에 의해. 불행 하 게도, 기존의 흐름 cytometry 프로토콜 표준화 노력에도 불구 하 고 아무런 합의에 있다 사용할 최적의 프로토콜. 6 , 7 , 8 , 9 , 10

기존의 cytometry 특정 MP 모집단 특성을 수 있습니다, 비록11 그것은 몇 가지 한계를 보고. 11 , 12 , 13 , 14 이러한 제한 중 일부는 소위에 있는 더 높은 전원 레이저 및 검출기를 사용 하 여 해결 되었습니다 앞으로 15 °-25 °에서 검출 뿐만 아니라 “작은 입자 옵션”,15,16 각도 분산형 및 칼 집 압력 수정 . 17 , 18 그럼에도 불구 하 고, 이러한 정교한 방법으로 결합 될 수 있는 신속 하 고 쉽게–를 사용 하 여 심사 방법 아직도 필요 조기 진단 마커로 미 활용 합니다. 미의 높은 수준은 정상적인 혈액 기증자19 의 1/3 정도에서 감지 되며 subclinical 조건을 나타낼 수 있습니다. 따라서, 헌 혈 된 혈액 제품에 높은 microparticle 수준 취약 받는 호환 되지 않을 수 있습니다. 20

혈소판 수혈을 제공할 때 비 면역 중-조건 어떤 점에서 환자의 몸 연속 수혈을 거부 하 고 순환 하는 혈소판의 상당 부분을 허용 하지 않습니다의 위험이 있다. 21 , 22 비 면역 중 낭비 수혈 될 수 있습니다, 그리고 건강 합병증 환자, 그리고 확장 된 병원에 대 한 유지 됩니다. 23 미의 높은 숫자를 포함 하는 혈소판 수혈 비 면역 중 취약 한 혈액 종양 환자에서의 개발에 대 한 기여 요인 수 있습니다. 20 미 취약 한 환자에 대 한 위험을 줄일에 대 한 심사에 의해 혈소판 수혈의 구성에 따라 혈소판 재고 관리 가능 하다. 그러나, 대부분 microparticle 테스트 혈소판5,12 에서 미의 격리가 필요 또는 그렇지 않으면 매우 노동 집약적인24,25 따라서 하지 구현할 수 있습니다 정기적으로 병원에 혈액 은행입니다.

설명 하는 기술은 여기 동적 산란 (DL)-광자 상호 관계 분광학 또는 준 탄성 산란을 사용 합니다. 수십 년 동안, 동적 산란 광범위 하 게 사용 되었습니다 제약 업계에서 자주 약물 제형 또는 유화 액 특성을 서브 미크론 범위에 있는 입자 크기. 26 , 그러나 27 , 이러한 응용 프로그램 개발 도구는 없습니다 최적화 화면 혈액 제품. 새로운 DLS 시스템 기술 한계를 극복 하 고 동적 빛 산란 혈소판 수혈의 심사에 대 한 유용 하 게 개발 되었습니다. 28

동적 산란 측정 레이저 빛으로 중단된 한 입자를 조명 하 고 흩어져 빛의 강도에 이동 하는 입자의 결과의 시간 변화를 분석 하 여 수행 됩니다. 또한,이 방법은 입자 속도 크기 사이의 반비례 관계를 사용 하 여 작은 입자 이동 하 고 큰 입자 크기 분포 및 샘플 구성의 상대 농도에 정보를 제공 하도록 천천히-이동 합니다. 평균 microparticle DL을 사용 하 여 microparticle 구성 요소의 콘텐츠 및 평균 반지름을 측정할 수 있습니다. 혈액 제품에 미의 콘텐츠 % MP 50-550 nm에서 입자 반지름에 대 한 측정 된 히스토그램에서 지역을 기반으로 제공 됩니다. 50 아래 반지름을 가진 입자를 동안 nm를 DL로 검색 하 여 보고 DLS 시스템 %MP에서 포함 되지 않습니다. 미에서 혈소판을 분리 하는 대신 혈소판 수혈의 이종 미 및 샘플에 있는 혈소판의 상대적인 내용에 따라 결정 됩니다. 사실, 혈소판 및 microparticle 봉우리의 비율 혈소판 수가 알려진 경우 절대 MP 농도 계산 하기 위해 사용할 수 있습니다. 19

DLS 시스템은 인간의 혈액 이나 혈액 제품에서 파생 된 표본에서 발견 하는 미에 대 한 질적 및 양적 정보 의료 전문가 제공 합니다. Cytometry, 전자 현미경,29 나노 분석30 또는31 감지 가변 저항 펄스 추적 대체 기술을 통해 설명 DL 기술의 주요 이점은 이다 샘플 준비: aliquots 혈소판 집중의 혈소판, 샘플 희석 또는 다른 수정에서 MP를 분리 하지 않고도 직접 측정할 수 있습니다. 9 , 17 또한, DL 절대 크기 조정 방법입니다 하 고 적절 한 굴절률을 가진 교정 구슬의 부족에서 고통을 하지 않습니다. 14 , 32

혈소판 활성화 및 MP 콘텐츠 사이의 상관 관계 이전 현미경33,20 에 의해 표시 되었습니다 및 병 적인 조건15,34, 에서 MP 콘텐츠 증가에서 유추할 수 있습니다. 35 , 36 고 조건 생체 외에서 혈소판을 활성화 하기 위하여 알려진. 19 , 37 , 그러나 38 , 더 연구는 필요 DL 측정 microparticle 콘텐츠 및 혈소판 활성화의 관계를 완전히 이해 합니다. 현재 우리의 지식에 따라 활성화 된 혈소판은 최고의 미의 높은 번호가 들어 혈액 종양 환자 비 활성화 누릴 적극적으로 환자39, 출혈의 치료 치료에 사용 되 없이 혈소판 또는 미20의 낮은 수준. 그것은 최근에 알려졌다 복구 및 안정적이 고, 주로 비 출혈 혈액 종양 환자40 단일 수혈에 이러한 혈소판의 생존 기증자 혈소판의 생체 외에서 응답 크게 영향 되지 않았다 그 . 이 발견에서 그 높은 MP 콘텐츠 식별 하는 혈소판 활성화 또한 아무 역할도 중요 한 환자 들의 예방 치료에 종결 될 수 있습니다. 그러나, 좁은 환자 선택 때문이 연구 해결 하지 않았다 복잡 한 환자 열 병 (연구에서 제외)에 대 한 기증자 요인의 영향, 하지 안정 하 고 많은 단지 하나 이상의 혈소판 수혈을 받을. -보유 하 고 하 중을 줄이기 위해 약속-어떻게 이러한 환자의 경우의 복잡성을 줄일 수 있습니다 질문 답이 남아 있습니다.

미 조기 표식 염증41,,4243,44 및 혈소판 활성화45 이며 따라서 많은 정상적인 기증자에서 발견. 19 따라서, 활성화 된 혈소판과 미는 혈소판 기부에. 그것은 합리적인 가설을 열, 즉, 완전히 활성화 된 타고 난 면역 시스템, 환자 활성화 된 혈소판의 수혈의 추가 도전 용인할 수 없다. 그러나, 연구는이 가설을 증명 하기 위해 필요 합니다. Microparticle 심사 혈소판 수혈의 내용에 대 한 현재의 불확실성을 완화 하 고 환자의 치료의 복잡성을 줄일 수 있습니다.

병원 혈액 은행에 비 활성화 활성화 된 혈소판의 비율에 따라 달라 집니다 주로 기증자 인구 전송, 방사선 조사, 병원 체 비활성화 및 혈소판 활성화에 증가 시킬 수 있는 다른 프로세스에 훨씬 낮은 정도로 집중 한다. 19 미국에 주요 병원 혈액 은행에서 데이터 보였다 혈소판 재고의 평균 조성은 활성화 하는 49%와 51% 비 활성화 (활성화 된 혈소판에 대 한 범위: 38-62%, 개인 커뮤니케이션). 혈액 제품 공급자 또는 병원 혈액 은행 microparticle에 의해 표시 된 혈소판 활성화를 기반으로 하는 그들은 생산 또는 수신, 및 그들의 재고를 관리 하려면 얼마나 많은 활성화 하 고 활성화 되지 않은 혈소판 집중을 알고 싶은 경우 콘텐츠,이 프로토콜은 그들에 대 한 적절 한 수 있습니다.

혈소판 성분 병원 혈액 은행 직접 상의 prophylactic에 대 한 비-활성화, 동종 혈소판 사용 및 활성화, 치료 적 사용에 대 한 다른 유형의 혈소판 수에 따라. 혈소판 검사 병원을의 환자 진료를 개선 하 고 비용을 감소 하는 사용 가능한 인벤토리 사용을 극대화 하기 위해 수 있습니다. 이 프로토콜은 기본 처리 및 혈액 제품의 조작에 익숙한 실험실 직원에 대 한 것입니다.

여기 어디 microparticle 내용에 따라 제품을 선택 하는 것이 바람직하다 미 병원 혈액 은행 재고 관리를 일상적으로 적용 될 수 있는 혈소판 수혈에 대 한 검사 방법이입니다. 이 프로토콜의 목적은 기증된 혈소판의 심사에 대 한 구현 및 DL의 평가 개요입니다. 설명된 프로토콜 샘플, 혈액 은행 작업 흐름 및 성능 특성으로 테스트의 통합 비-침략 적 접근의 일반적인 질문을 해결 합니다.

Protocol

다음 프로토콜 모든 캐나다 혈액 서비스 (CBS) 지침에 따라 수행 되었습니다. 자원 봉사자 수 있습니다 그들의 기부금을 동의 했다이 연구를 수행 하는 데 사용. 혈소판 집중 CBS 표준 운영 절차에 따라 준비 되었다. 여기에 설명 된 모든 성능 테스트 수행 되었다 센터에서 혈액 연구 브리티시 컬럼비아 대학교, 밴쿠버, 캐나다에 대 한 기관 연구 윤리 위원회 승인. 1. 품질 관리 검사 DLS 시스템의 올바른 작동을 확인 하는 날 테스트 당 품질 관리 검사를 적어도 한 번 수행 합니다. 사용에 대 한 제조업체의 지침에 따라 제공 된 제어 구슬 (50 nm radius)를 측정 합니다. 냉장에서 제어 유리병을 검색 하 고 따뜻한 실내 온도에 15 분을 허용. 구슬 사용 하기 전에 실내 온도에 equilibrate 해야 합니다. 샘플을 준비 하는 워밍업 기간 15 분 레이저 첫 번째 샘플은 테스트를 위해 준비 하는 시간에 의해 완성 전에 DL 시스템을 켭니다. 일단 콘솔 시작 했다에 로그인 하 고 시스템 테스트 옵션 컨트롤 샘플 측정을 선택 터치 스크린에 지침을 따르십시오. 소용돌이 믹스 10 유리병 대표 샘플을 보장 하는 s. 100 µ L 고정된 볼륨 피 펫, 피 펫 팁 및 테스트 키트에서 모 세관을 사용 하 여 컨트롤 구슬과 모 세관을 채우십시오. 테스트가 완료 되 면 DL 시스템의 화면의 지침을 따릅니다.참고: 제어 구슬 테스트 결과 자동으로 컨트롤 비드 바코드 라벨 및 패스에 저장 된 정보에 비해 또는 샘플 정보 뿐 아니라 실패 알림 테스트의 끝에 DLS 시스템 화면에 표시 됩니다. 2. 혈소판 집중에서 샘플을 얻기 참고:이 단계는 일상적인 혈소판 재고 관리에 대 한 모 세관을 테스트 하는 DL에 혈소판 수혈에서 비-침략 적 샘플링에 대 한 프로세스를 설명 합니다. 개요는 그림 1에 표시 됩니다. 필요한 액세서리: 튜브 실러, 수동 튜브 스 트리 퍼가 위, 그리고 스플래시 방패. 안 된 재고에서 혈소판 집중을 제거 합니다. 사용 하지 않는 샘플링 주머니에서 혈소판 제품의 샘플을 얻기 (2.3 단계로 진행) 또는 튜브 세그먼트 (비어 있는 경우 2.4 단계로 진행 또는 2.5 단계 아니라면 빈).주머니를 분리 하려면 튜브 또는 세그먼트 튜브 튜브 실러를 사용 합니다. 튜브 실러, 운영을 제조업체의 지침을 따르십시오. 짧게, 2 개의 온수 턱 사이 정확한 위치에 봉인에 튜브 클램프. 핸드헬드 장치에서 녹은 튜브 함께 누르고 (기간 녹색 빛으로 표시 됩니다) 레버를 누르는 동안 높은 압력에서 냉각 결과 영구, 누출 증거 물개에. 주머니에서 샘플링 5 부드러운 수평 운동에 의해 잘 혈소판 가방의 콘텐츠를 혼합 s (팁 끝에 5 번). 주머니에 클램프를 엽니다. 주머니 대피 되 고 자체적으로 작성 합니다. 100 µ L 샘플 DL 테스트에 필요한 것으로 주머니를 완전히 채울 필요는 없습니다. 열 씰링 연결 튜브 튜브 실러에 의해 가방에서 주머니를 분리 합니다. 3 단계로 진행 합니다. 빈 배관에서 샘플링 혈소판 가방 확인 튜빙 빈 저장 된 및 튜브 블록 장소에 아직도 있다. 시각적으로 상당한 양의 튜브에 혈소판 집중이 아닌지 확인 하 고 튜브를 검사 합니다. 튜빙 비어 있지 않은 경우 2.5 단계로 진행 합니다. 롤러 사이 튜브를 집어넣은 핸들을 압축 하 여 가능한 튜브 블록 주변으로 배관에 튜브 스 트리 퍼를 닫습니다. 수직으로 가방을 걸어 고 압축 스 트리 퍼 핸들 유지. 폐쇄는 스 트리 퍼를 유지 하는 동안 튜브 블록을 해제 합니다. 천천히 천천히 스 트리 퍼 뒤에 채우기 위해 튜브에 대 한 허용 하는 빈 튜브 아래로 스 트리 퍼를 당겨. 스 트리 퍼 아래 섹션은 완전히 팽창 될 때까지 또는 스 트리 퍼 튜브의 끝의 1 인치 이내 때까지 계속 합니다. 일단 멈추는 포인트는 스 트리 퍼와, 사용 열 튜브 실러 밀봉 튜브 스 트리 퍼 1 인치. 수동 튜브 스 트리 퍼의 핸들을 해제 합니다. 열 인감 다시 테스트 세그먼트를 만드는 이전 인감 위에 1 ~ 2 인치. 혈소판 단위에서 테스트 세그먼트를 잘라. 이 세그먼트는 DL 테스트에 사용 됩니다. 비어 있지 않은 튜브에서 샘플링 수직으로 가방을 꽉과 장소를 하는 경우에 배관 블록을 놓습니다. 시각적으로 어떤 중대 한 단단한 덩어리 인지 확인 하 고 튜브를 검사 합니다. 단단한 덩어리로 존재 할 경우 가방에 박탈 될 수 없는 그런 그들 위에 봉인. 가까운 가능한 배관의 밀봉된 끝으로 배관에 튜브 스 트리 퍼를 닫습니다. 집어넣은 튜브 롤러 사이 그리고, 클램핑 힘을 유지 하면서 핸들을 압축 하 여 가방에는 튜브의 내용을 스트립 가방 쪽으로 튜브 스 트리 퍼 튜브를 따라 이동 합니다. 걸려 후크에서 혈소판 가방을 제거 하 고 부드럽게 혼합 5 가방 s 팁 그것은 끝에 5 번 스 트리 퍼를 유지 하는 동안에 의해 폐쇄. 폐쇄 스 트리 퍼를 유지 하면서 수직으로 가방을 걸어. 천천히 천천히 스 트리 퍼 뒤에 채우기 위해 튜브에 대 한 허용 하는 빈 튜브 아래로 퍼 당겨. 스 트리 퍼 아래 섹션은 완전히 팽창 될 때까지 또는 스 트리 퍼 튜브의 끝의 1 인치 이내 때까지 계속 합니다. 일단 멈추는 포인트는 스 트리 퍼와, 사용 열 튜브 실러 밀봉 튜브 스 트리 퍼 1 인치. 스 트리 퍼를 놓습니다. 열 인감 다시 테스트 세그먼트를 만드는 이전 인감 위에 1 ~ 2 인치. 차단 하 고 튜브의 마지막 부분을 삭제. 혈소판 단위에서 테스트 세그먼트를 잘라. 이 세그먼트는 DL 테스트에 사용 됩니다. 3. 모 세관을 테스트 하는 DL로 샘플 작성 스플래시 방패와 깨끗 하 고 건조가 위를 사용 하 여 튜브 또는 세그먼트 테스트 주머니의 한쪽 끝을 잘라.참고: DL 테스트에 사용 되는 모 세관 즉시 채울 수 합니다. 모 세관 (조립된 100 µ L 고정된 볼륨 피 펫 피 펫 팁, 모 세관)는 모 세관으로 열린된 주머니 또는 튜브 세그먼트에서 직접 샘플을 그리는 샘플링 도구를 사용 하 여 입력 합니다. 부드럽게 부드러운 트위스트 및 용지함에 대 한 압력을 적용 하는 동안 세관 실 란 트로 채워진된 모 세관을 추진 하 여 채워진된 모 세관의 하단 인감. 단단히 세관 실 란 트에 포함 된 고정 볼륨 피 펫 및 모 세관 남아 보장 하는 모 세관에서 팁 100 µ L를 분리 합니다. 모 세관 튜브 실 란 트 트레이에서 모 세관 제거, 이소프로필 알코올 솜으로 닦 고 아무 공기 거품이 부드럽게 모 세관의 하단을 터치 하 여 갇혀 있다 확인 합니다. DLS 시스템에 모 세관을 놓습니다. 4. DL 테스트 수행 MP 테스트 옵션 microparticle 콘텐츠의 혈소판 샘플을 측정 하기 위한 새로운 DL 테스트 시작을 선택 합니다. 샘플 정보 (기부 식별 번호 (ISBT), 컬렉션/생산 만료 날짜와 제품 코드) 입력 바코드 스캐너를 사용 하 여 또는 수동으로. 제품 코드 사용할 수 있는 경우는 DLS 시스템 수 있습니다 유체 매체 정보를 추출, 적절 한 액체 매체를 수동으로 선택 (대부분 혈소판에 대 한 집중 플라즈마를 선택 하지만 혈소판 첨가제 솔루션 (PA)를 포함 하는 샘플에 대 한 입력은 잔여 플라즈마의 비율)입니다.참고: 공칭 65%에서 파 비율에 작은 편차 최소 계산된 MP 반지름만 하지 %MP 영향을 미치는 점도 (DLS 시스템에 의해 자동으로 계산 해)에 작은 오류를 발생 합니다. DLS 시스템 지시 하는 때에 모 세관을 놓고 테스트를 시작 합니다. 테스트가 완료 되 면 모 세관 홀더 및 시설 지침에 따라 적절 하 게 소모품의 dispose에서 샘플을 제거 합니다. 모 세관 홀더 및 시설 지침에 따라 적절 하 게 소모품의 dispose에서 샘플을 제거 합니다. 결과, 대 한 예를 들어 오렌지에 해당 하는 색상으로 혈소판 가방 태그 비-활성화 (균질) %MP 동등 하거나 15% 및 대 한 분홍색 아래 활성화 (이기종) % MP 15% 이상. 그림 1 : 방법 개요. 병원 혈액 은행에서 일상적인 혈소판 재고 관리에 대 한 수행 하는 단계의 개요: 미 식별 하 테스트는 DL 수행 집중, DL 측정 모 세관으로 샘플을 로드는 혈소판에서 샘플을 얻기 그리고 보고 microparticle 활성화 된 혈소판을 식별 하기 위해 콘텐츠를 사용 하 여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Representative Results

평균 준비 시간DLS 시스템을 사용 하 여 프로세스를 심사 하는 혈소판은 그림 1에 요약 됩니다. 혈소판은 혈액에서 영수증의 시간에 DLS 시스템으로 테스트 됩니다. 표 1 에 설명으로 숙련 된 사용자에 대 한 평균 준비 시간 정리 하는 동안 2 분 23 s 이며 테스트 후 작업 시간 14 s와 46 s, 각각. 총, 평균 사용자가 3 분 및 23 테스트 당 실습 시간의 s. 활동 활성 시간 도보 거리 테스트 시간 총 DLS 시스템 준비 14 s 샘플링 도구 조립 28 s 세그먼트를 얻을 52 s 모 세관을 작성 하 고 테스트 시작 49 s 5 분 정리 14 s 태그 및 재고 혈소판 가방 46 s 샘플 당 필요한 총 시간 3 분 23 s 5 분 8 분 23 s 표 1: 활성 테스트 시간 고장. 테스트 자체는 평균 기간이 5 분의 도보 멀리 테스트가입니다. 평균 사용자 3 분 23의 DL 시스템 테스트를 위한 준비,이 프로토콜에 따라 샘플 테스트와 혈소판 가방 태그 걸립니다. 정밀DLS 시스템의 정밀도 0-7 세 microparticle 수준 평가 되었다 %, 12-25%, 28-75%. %MP 임상 관련 범위 3-75% 이다. 두 연산자는 병렬로 두 DLS 시스템 운영 16 일에 대 한 낮은, 중간 및 높은 제어 샘플 테스트. 샘플 테스트 하루에 중복, 하지만 임의의 순서로 테스트 되었습니다. 표 2 는 혈소판을 기준으로 % 미 (%MP)에 대 한 DL 측정 장치 내에서 정밀 요약 되어 있습니다. Microparticle 콘텐츠 낮은 매체 높은 %MP (%)을 의미 4.4 19.5 53.8 표준 편차 (%) 1.8 2.6 5.8 CV (%) 40.4 13.2 10.6 표 2: % 미 (%MP)의 장치 내에서 정밀. 매우 낮은 microparticle 콘텐츠 작은 혈소판 %에 기여할 수 있습니다 MP 인 낮은 microparticle 콘텐츠 샘플에 대 한 다양성을 증가 했다. 표 3 50-550 nm 사이의 평균 microparticle 반지름에 대 한 DL 측정 장치 내에서 정밀도를 보여준다. Microparticle 콘텐츠 낮은 매체 높은 반경 (nm)를 의미 331 161 188 표준 편차 (mm) 133 41 25 CV (%) 40.1 25.2 13.5 표 3: microparticle 반지름의 장치 내에서 정밀. 매우 낮은 microparticle에서 콘텐츠 작은 혈소판 % 미 (%MP)에 기여할 수 있습니다 낮은 microparticle 콘텐츠 샘플에 대 한 가변성을 증가 결과로. 표 4% 미 (%MP)에 대 한 DL 측정의 재현성을 보여줍니다. Microparticle 콘텐츠 낮은 매체 높은 %MP (%)을 의미 4.4 29.2 53.6 재현성 (%) 1.5 2.3 5 CV (%) 35 11.8 9.4 표 4: % 미 (%MP)에 대 한 동적 빛 분산 (DLS) 측정의 재현성. 선형성그림 2 쇼 DL 결과 선형, 즉, 직선 샘플의 할당 된 값에 대해 맞는. 7 샘플 다른 microparticle 콘텐츠로 준비 되었다. 높은 (MP7) 및 낮은 (MP1) microparticle 내용과 일치 혈소판 농도 샘플 준비 되었고 중간 샘플 (MPx)를 만들려고 다른 비율에 혼합. Cytometry 앞에서 설명한19 와 DL와 샘플 테스트 및 각 농도에서 %MP 결과 플롯은 입력 및 출력으로. 결정 계수 0.985 발견 했다. 낮은 높은 microparticle 콘텐츠에 대 한 DL 히스토그램의 예는 그림 3A에 표시 됩니다. DLS 결과 cytometry (그림 3B)에 의해 확인 되었다. 그림 2 : Cytometry 및 DL 결과의 비교. %MP 사이 선형 관계 Flow Cytometry (입력) 및 결정 (출력), DL 오픈 기호 ○로 표시 하 고 두 개의 샘플에서 원래 DL 데이터는 그림 3에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 :를 활성화 하 고 활성화 되지 않은 혈소판 Microparticle 콘텐츠. (A) MP 콘텐츠 활성화 된 혈소판 (파선) DL 결과 비 활성화 혈소판 (실선)에 4%에 비해 57%. 37 ° C의 측정 온도에서 테스트를 수행한 1.06의 플라즈마 점도 설정 x10-3 Pa·s, 및 200-600 kHz 사이 총 강도 설정. (B) (A);과 같이 동일한 샘플의 cytometry 결과 (19위에서 설명한 대로) 흐름 앞으로 분산형 히스토그램에서 P1 및 P2 MP 및 혈소판 게이츠를 각각 나타냅니다; 활성화 된 혈소판에 대 한 이벤트의 (왼쪽된) 76%는 비 활성화 혈소판 (오른쪽)에 대 한 6%에 비해 MP 게이트로 떨어졌다. 선형 회귀선 % MP cytometry 지속적으로 높은 결과, 배경 잡음의 지속적인 상대적 기여도 제안 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 특이성/간섭국제 조직 표준화 (ISO)에 대 한 감지 하거나 다른 수량 샘플에 존재 하는 동안만 measurand 측정 측정 절차의 기능으로 분석 특이성을 정의 합니다. Microparticle 심사의 분석 특이성 적혈구 (RBC)에 의해 영향을 받을 수 있습니다. DLS MP 콘텐츠 혈소판 콘텐츠를 기준으로 측정합니다. RBC 증권의 산란 기여, 혈소판의 산란 기여에 포함 되어 있기 때문에 MP의 상대적 기여도 감소 방해 수 있습니다. 혈액 제품에서 허용 RBC 콘텐츠에 대 한 규제 제한을 존재; 임계값의 보수 변환에 의해 권장 AABB 혈소판 집중 2 mL에 허용 RBC 농도 대 한 RBC 8.0에서 혈소판 결과의 한 단위로 포장 x1010 셀/L (가정: RBC 볼륨은 8.5 x10-14L, 보통 포장된 RBC의 68%, 혈소판 단위의 볼륨은 200 mL). 다른 제품에서 보고 된 잔여 RBC 농도이 임계값46잘 같습니다. 3 다른 기증자는 3 개의 독립적인 실험에 대 한 자격으로 두 개의 다른 일에 혈소판 및 적혈구 (RBC)을 기증 했다. 혈소판 집중 (참조 샘플)에서 초기 RBC 콘텐츠는 0.05-0.15 x109 셀/L는 hemocytometer로 결정. 5 추가 샘플 급상승에 알려진된 양의 RBC 혈소판 농축액; aliquots에 의해 만들어진 이 예제에서 타겟 RBC 레벨은 1.0, 5.0, 10, 40 및 80 x109 셀/l. 적혈구의 간섭 임계값은 약 1.0 x1010 셀/L (그림 4), 또한 수준에서 붉은 혈액 세포의 존재는 시각적으로 분명 (그림 5)와 상관. 이 수준 위의 %MP 과소 평가 시각적으로 레드 샘플-어느 포함 증권 보다는 헤모글로빈의 보고 microparticle 콘텐츠는 너무 낮은 것을 의미. 그림 4 : %MP (DL)와 RBC 농도 (셀/L) 사이 선형 관계. RBC 농도 0.1의 증가 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010및 8.0 x1010 셀/L (왼쪽에서 오른쪽) 3 독립적인 실험 (○ 실험 1, ● 실험 2, □ 실험에서 3, 선형 회귀 라인 표시 됩니다 각 실험에 대 한). 1.0 보다 x1010 증권/L %MP 싼 이끌어 낸다. RBC 포함 샘플의 시각적 모양은 그림 5에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 샘플 포함 된 RBC의 시각적 모양을. 빨갛게 혈소판의 샘플링 포함 RBC 농도 0.1의 x109, 1.0 x109, 5.0 x109, 1.0 x1010, 4.0 x1010및 8.0 x1010 셀/L 왼쪽에서 오른쪽으로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 정확도정확도 단일 측정 결과 샘플에 할당 된 진정한 수량 값으로 정의 됩니다. 이 측정 오차 측정 바이어스에 의해 추정 하는 체계적인 구성 요소 및 표준 편차에 의해 견적 하는 임의의 구성 요소에 포함 되어 있습니다. 따라서, 측정 결과의 정확도 진실과 정밀의 조합 이다. 비드 표준 DLS 테스트의 정확도 결정 하기 위해 사용 되었다. 정확도 3-75 %MP 분석 결과의 임상으로 관련 된 범위 내에서 두 개의 농도에서 평가 했다. 참조 비드 혼합물 참조 구슬에는 알려진된 크기와 농도 때문에 알려진된 농도의 샘플을 준비 하 사용 되었다. 따라서, 참조 구슬 샘플 원하는 입자 크기와 농도를 혼합 수 있습니다. 125 nm 반경 가진 표준 폴리스 티 렌 구슬 미를 나타내는 데 사용 되었다 그리고 1.5 µ m 반경 구슬 혈소판을 나타내는 데 사용 되었다. Microparticle 분석 결과의 정확도 약 20%와 50 %MP 콘텐츠 비드 혼합물으로 평가 했다. 표 5와 같이 참조 구슬에 대 한 분석의 인증서에 문서화 입자 반지름 측정된 입자 반지름의 정확도 비교 되었다. 125 nm 구슬 1.5 µ m 비즈 분석의 인증서 분석의 인증서 20% MP 50% MP 20% MP 50% MP 반지름을 의미 122.0 113.8 124.4 1.5 1.6 1.60 표준 개발 4.5 2.83 3.6 0.035 0.06 0.07 이력서 3.60% 2.48% 2.89% 2.20% 3.74% 4.05% 정확도 6.70% 2.00% 6.50% 6.30% 표 5: 동적 빛 분산 (DLS) 측정의 정확성. DL에 대 한 크기 비교 혼합물에 125 nm 반경 및 1.5 µ m 반경 구슬에 대 한 분석의 인증서에 대 한 결과.

Discussion

이 프로토콜 microparticle 심사 혈소판 집중 같은 생물학 견본에서 발견 높은 입자 농도 대 한 최적화에 대 한 동적 산란 방법을 설명 합니다. DL 방법은 기본적으로 정확 하 게 크기를 측정 하 표준화 된다. 미의 상대 농도 절대 농도에 혈소판 농도가 알려져 있고 혈소판 피크 지역 때 참조 피크19로 변환할 수 있습니다. 혈액학 분석기 혈소판으로 농도 얻은 일반적으로 또는 교류 cytometers 이러한 방법을 DL 동반자 기술을 고려 될 수 있다.

DLS 시스템의 기능 제어 구슬을 정기적으로 실행 하 여 보험입니다. 증류수는 배경 잡음은 최소한의 확인을 측정할 수 있습니다. 상용 혈소판 기준 MP 긍정적인 컨트롤로 125 nm 반경 구슬의 추가 후에, 및 MP 음수가 컨트롤로 분석할 수 있습니다. 관심의 농도 MP의 생물 학적 범위 내에서 절차는 실용적이 고 빠른 혈액 은행 루틴의 일환으로 수행 하는.

Cytometry, 반대로이 방법은 하지 기반으로 입자의 산란 강도 하지만 오히려 그들의 브라운 모션의 속도 비교 합니다. 따라서, exosomes는 또한 그들의 작은 크기에도 불구 하 고 검출 될 수 있다 하 고 MP에서 별도로 보고 됩니다.

심사 도구로 설계,이 방법의 한계 미의 다른 유형을 구별을 하지 못하는 관련이 있습니다. 추가 격리 단계; 사용 개선 위한 잠재적인 공간이 있다 마그네틱 비드 캡처를 결합 하는 항 체를 통해 미의 특정 제거 전후 샘플 테스트 수 있습니다. 또한, 모든 미는 chylomicrons 혈47,48 및 작은 박테리아 또는 바이러스6 형성 microparticle 범위에 보고 됩니다 때문에 파생 셀 감지 가정 수 없습니다. 그러나, 다른 안전 장치를 피하기 위해 높은 lipemic 또는 병원 혈액 은행 재고 입력을 오염 된 혈소판 혈액 공급 내에서 존재 한다.

응고 제 샘플에서의 혈소판 활성화 및 따라서 MP 콘텐츠49의 범위를 영향을 줍니다. 다른 제품의 비교에 대 한이 요인은 고려 될 필요가 있다. 또한, 플라즈마 파 같은 MP 무료 정지 미디어의 교환 MP 콘텐츠 및이 결정 하기 위한 임계값에 영향을 미칠 것입니다-경우에 집중에서 잔여 플라즈마 내에서 남아 있는 원래 MP 콘텐츠의 1/3 정도 따라서 낮은 MP 콘텐츠 임계값 100% 플라스마에서 혈소판 활성화의 동일한 수준을 나타냅니다. 백분율 MP 혈소판 기준 MP 내용입니다. 이전 파 제품의 평균 혈소판 수는 낮은 평균 %MP 되었다 아직도 9.519보고 되었다. 싶어 서 혈소판 허가 미국에 대 한 %MP 임계값은 현재 10%로 설정 됩니다.

혈소판 집중에 MP의 기본 소스는 기증자, 혈소판에 긴장을 일으키는 원인이 되는 프로세스 스트레스 혈소판의 민감성에 따라 MP 수준 증가-혈소판 활성화 이미 높은 경우 사소한 스트레스와 같은 확장 된 수명, 병원 체 비활성화, 세척, 방사선 또는 장거리 전송은 MP 내용에 상당한 증가를 발생할 수 있습니다. 이러한 스트레스의 크게 균질, 비 활성화 혈소판19영향을 보였다. 또한, 주의 해야 될 모 세관 내의 샘플 구성 변경에 대 한 잠재력을 지불 아니라면 준비 (이 프로토콜의 단계 3의 완료) 후 즉시 테스트.

이 프로토콜의 초점은 결정 입자와 혈소판 활성화의 biomarkers로 미를 사용 하 여 혈소판 수혈에의 구성에 있습니다. 혈소판 수혈 중 비 활성화 (오렌지) 태그 또는 활성화 (핑크) 15%의 microparticle 백분율 임계값에 따라. MP 100% 플라스마에 있는 혈소판에 대 한 경험적으로 여러 사이트에서 평균 66번째 백분위 수로 결정 했다 15%의 임계값입니다.

일상적인 microparticle DL와 심사에 따라 혈소판 재고 관리의 목적은 비 면역 혈소판 중을 방지 하 여 환자 관리 및 드라이브 비용 효율성을 향상 시킬 것입니다. 혈소판 가방의 심사에 대 한 DL 시스템의 구현에는 혈소판 중 위험이 가장 환자 인구를 비 활성화 된 혈소판을 직접 사용자 수 있게 된다.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 감사 혈액 기증자와 인원 캐나다 혈액 서비스 네트워크 센터에 적용 개발에 대 한 수집 및이 연구에 사용 된 혈소판의 생산. 우리 인정 캐나다 재단 혁신 그리고 마이클 스미스 재단 건강 연구를 위한 인프라 혈액 연구를 위한 UBC 센터에서 자금에 대 한. 게시에 대 한 자금 LightIntegra 기술 주식 회사, ThromboLUX의 제조 업체에 의해 제공 했다.

Materials

ThromboLUX-M LightIntegra Technology Inc.  LPN120 DLS System
ThromboSight Software LightIntegra Technology Inc.  LPN124 DLS analysis software
Capillaries LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) LPN065 Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated
MiniPet  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) LPN082 100 µL fixed volume pipette for sampling  
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) LPN080 Pipette tips for sampling
Critoseal  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) LPN075 Capillary Tube Sealant
Dukal Alcohol Pad or equivalent LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) LPN085 Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)
Control beads, 50 nm radius LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) LPN128 Control beads
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm PolySciences Inc. 64060 Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm PolySciences Inc. 64014-15 Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 – 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent Genesis BPS 428-SE640 Tube sealer
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent Fresenius Kabi 6R4452 Manual tube stripper
Biohazard Shield – Cell Counter or equivalent CardinalHealth S1389-75 Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent Corning Incorporated 6775 Vortex mixer
FACSCanto II Flow cytometer  with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent BD Biosciences 338960 Flow cytometer
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Referencias

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Millar, D., Murphy, L., Labrie, A., Maurer-Spurej, E. Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions. J. Vis. Exp. (131), e56893, doi:10.3791/56893 (2018).
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