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Medicina

Routine-Screening Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen

Published: January 31, 2018
doi:
10.3791/56893
, , ,
1Research & Development,LightIntegra Technology Inc., 2Quality Engineering & Regulatory,LightIntegra Technology Inc., 3Department of Pathology and Laboratory Medicine; Center for Blood Research,University of British Columbia, 4Canadian Blood Services

Summary

Thrombozyten-Inventar-Management basierend auf screening-Mikropartikel Inhalte in Thrombozyten-Konzentraten ist eine neue Qualität Verbesserungsinitiative in Krankenhaus-Blutbanken. Das Ziel ist, aktiviert von nicht aktivierten Thrombozyten zur Optimierung der Nutzung von Blutplättchen zu unterscheiden. Eine nicht aktivierte Thrombozyten für Hämatologie-Onkologie-Patienten könnte ihr hohe Risiko feuerfesten zu reduzieren.

Abstract

Thrombozyten-Inventar-Management basierend auf screening-Mikropartikel Inhalte in Thrombozyten-Konzentraten ist eine neue Qualität Verbesserungsinitiative für Krankenhausblutdepots. Zellen-Fragment aus Mikropartikel (MP), wenn sie gestresst sind. Blut und Blut können Zellfragmente aus einer Vielzahl von Zellen, vor allem von aktivierten Thrombozyten enthalten. Bei der Durchführung ihrer Rolle als angeborene immune Zellen und Hauptakteure in Blutgerinnung und Blutstillung Thrombozyten verformen und Mikropartikel zu generieren. Mit dynamischen Lichtstreuung (DLS)-basierte Mikropartikel-Erkennung, es ist möglich, aktivierte (hohe Mikropartikel) von nicht aktivierten (niedrige Mikropartikel) Plättchen im Transfusionen unterscheiden, und optimieren den Einsatz von diesem knappen Blutprodukt. Bisherige Untersuchungen zeigen, dass nicht aktivierte Thrombozyten für den prophylaktischen Einsatz in Hämatologie-Onkologie-Patienten könnte ihr Risiko reduzieren des Werdens feuerfesten und Verbesserung der Patientenversorgung. Das Ziel dieser Screening-Methode ist routinemäßig zu unterscheiden von nicht aktivierten Thrombozyten aktiviert. Die hier beschriebene Methode beschreibt die Schritte für die routinemäßige Thrombozyten Bestandsführung in einer Blutbank Krankenhaus durchgeführt werden: Erlangung einer Probe aus einer Thrombozyten-Transfusion, laden die Probe in der Kapillare für DLS-Messung, Durchführung der DLS zu testen identifizieren Sie Mikropartikel und mit den gemeldeten Mikropartikel-Inhalt zu aktivierte Thrombozyten identifizieren.

Introduction

Das Interesse an Mikropartikel hat sich vor allem um ihre Beteiligung an der Zelle zu Zelle Kommunikation und biologische Prozesse gedreht. 1 , 2 , 3 vor kurzem, haben Mikropartikel auch Interesse als potentielle frühe diagnostische Marker für Autoimmun- und Herz-Kreislauf-Krankheiten angezogen. 4 , 5 Mikropartikel, auch bekannt als extrazelluläre Vesikel oder Exosomen, wurden weitgehend durch Durchflusszytometrie untersucht. Leider, trotz Bemühungen, konventionelle Flow Cytometry Protokolle zu standardisieren gibt es keinen Konsens über die optimale Protokoll zu verwenden. 6 , 7 , 8 , 9 , 10

Obwohl konventionelle Durchflusszytometrie spezifische MP Subpopulationen charakterisieren kann, berichtet11 es hat einige Einschränkungen. 11 , 12 , 13 , 14 diese Einschränkungen behandelt wurden mit höheren-Power-Laser und Detektoren in einem so genannten “kleinen Partikeln Option”,15,16 , sowie Erkennung bei 15-25 ° nach vorne streuen Winkel und Scheide Druck geändert . 17 , 18 jedoch ist eine schnelle und einfach zu bedienende Screening-Methode, die mit diesen raffinierten Methoden kombinierbar sind erforderlich, um Mikropartikel als frühe diagnostische Marker zu nutzen. Erhöhte Konzentrationen von Mikropartikeln in etwa ein Drittel der normalen Blut Spender19 nachweisbar sind und könnte darauf hindeuten, subklinische Bedingungen. Daher möglicherweise hohen Mikropartikel Ebenen in gespendetes Blutprodukte mit gefährdeten Empfängern kompatibel. 20

Bei der Bereitstellung von Thrombozytentransfusionen besteht nicht-immunen Feuerfestigkeit – ein Zustand, wobei den Körper des Patienten weist in Folge Transfusionen und nicht zulassen, dass einen erheblichen Teil der Thrombozyten zirkulieren. 21 , 22 kann nicht-immunen Feuerfestigkeit verschwendet Transfusionen, gesundheitlichen Komplikationen für Patienten und erweiterte Krankenhaus bleibt. 23 mit hohen Zahlen von Mikropartikeln Thrombozytentransfusionen können ein entscheidender Faktor für die Entwicklung der nicht-immunen Feuerfestigkeit in gefährdeten Hämatologie-Onkologie-Patienten sein. 20 es ist möglich, die Plättchen nach der Zusammensetzung des Thrombozytentransfusionen durch Screening für Mikropartikel, wodurch sich das Risiko für gefährdete Patienten Inventarverwaltung. Jedoch die meisten Mikropartikel-Tests erfordern Isolation der Mikropartikel von Thrombozyten5,12 oder sonst sehr arbeitsintensiv sind intensive24,25 und kann daher nicht routinemäßig im Krankenhaus umgesetzt werden Blutbanken.

Die beschriebene Technik nutzt hier dynamische Lichtstreuung (DLS) – auch bekannt als Photon Korrelation Spektroskopie oder quasi-elastischer Lichtstreuung. Seit Jahrzehnten wurde dynamische Lichtstreuung ausgiebig in der pharmazeutischen Industrie zur liposomalen Wirkstoff-Formulierungen oder Emulsionen zu charakterisieren sind wo Partikelgrößen im Sub-Mikrometer-Bereich. 26 , 27 jedoch sind für diese Anwendungen entwickelten Tools nicht Bildschirm Blutprodukte optimiert. Ein neues DLS-System wurde entwickelt, um technische Grenzen zu überwinden und dynamische Lichtstreuung für das Screening von Thrombozytentransfusionen nützlich zu machen. 28

Dynamische Lichtstreuung Messung erfolgt durch die suspendierten Teilchen mit Laserlicht beleuchtet und Analyse der zeitlichen Abweichungen der gestreuten Lichtintensität als Folge von Partikeln bewegen in der Schwebe. Darüber hinaus verwendet diese Methode die inverse Beziehung zwischen Partikelgeschwindigkeit und Größe – kleine Partikel bewegen sich schnell und große Partikel bewegen sich langsam – Informationen über die Größenverteilung und relativen Konzentrationen der Probe Komponenten. Mit DLS, die mittlere Mikropartikel kann Inhalte und mittleren Radius der Mikropartikel Komponente quantifiziert werden. Der Inhalt der Mikropartikel im Blutprodukt wird % MP auf Grundlage des Bereichs im gemessenen Histogramm für Partikel Radien von 50 bis 550 nm angegeben. Während Partikel mit Radien unter 50 nm von DLS erkannt und gemeldet durch das DLS-System, sie sind nicht in % MP enthalten sind. Anstatt Mikropartikel von Blutplättchen zu isolieren, wird die Heterogenität der Thrombozytentransfusionen anhand der relative Inhalt von Mikropartikeln und Plättchen in einer Probe bestimmt. In der Tat kann das Verhältnis der Thrombozyten und Mikropartikel Gipfel verwendet werden, um die absolute Konzentration der MP zu berechnen, wenn die Thrombozytenzahl bekannt ist. 19

Das DLS-System bietet medizinischem Fachpersonal mit qualitativen und quantitativen Informationen über Mikropartikel gefunden in Proben aus menschlichem Blut oder Blutprodukte abgeleitet. Der größte Vorteil der beschriebenen DLS-Technik über alternative Techniken wie Durchflusszytometrie, Elektronenmikroskopie,29 Nanopartikel tracking Analyse30 oder abstimmbaren resistiven Puls spüren31 ist die Probenvorbereitung: Aliquote von Thrombozyten-Konzentraten können direkt gemessen werden, ohne die Notwendigkeit, MP von Thrombozyten, Probenverdünnung oder andere Änderungen zu isolieren. 9 , 17 außerdem DLS ist eine absolute Dimensionierung Methode und leidet nicht die mangelnde Kalibrierung Perlen mit entsprechenden Brechungsindex. 14 , 32

Eine Korrelation zwischen Thrombozyten Aktivierung und MP Inhalt wurde zuvor durch Mikroskopie33,20 gezeigt und kann von der Erhöhung des Anteils der MP in pathologischen Zuständen15,34, abgeleitet werden 35 , 36 und unter in-vitro- Bedingungen bekannt, Thrombozyten zu aktivieren. 19 , 37 , 38 jedoch sind weitere Studien erforderlich, um die Beziehung der DLS gemessen Mikropartikel Inhalt und Thrombozyten Aktivierung vollständig zu verstehen. Basierend auf unserem derzeitigen Kenntnisstand, dass aktivierte Thrombozyten hohe Zahl von Mikropartikeln, enthalten sie sind am besten für therapeutische Behandlung aktiv Patienten39, Blutungen, während Hämatologie-Onkologie-Patienten von nicht aktivierten profitieren verwendet Thrombozyten mit Nein oder niedrige Konzentrationen von Mikropartikeln20. Es wurde kürzlich berichtet, dass in Vitro Reaktionsfähigkeit des Spenders Thrombozyten nicht deutlich die Erholung und das Überleben der diese Plättchen in einzelnen Transfusionen, stabile und vor allem nicht blutend Hämatologie-Onkologie Patienten40 Auswirkungen . Aus dieser Befund könnte geschlossen werden, dass Thrombozyten Aktivierung durch hohen Gehalt an MP identifiziert auch keine bedeutende Rolle in der prophylaktischen Behandlung von Patienten spielt. Jedoch wegen der engen Auswahl der Patienten dieser Studie nicht eingegangen die Auswirkungen der Spender Faktoren für komplexe Patienten, die Fieber (aus der Studie ausgeschlossen), nicht stabil und viele mehr als nur ein Thrombozyten-Transfusion zu erhalten. Die Frage, wie die Komplexität dieser Patientenfälle reduziert werden kann – die hält das Versprechen, Feuerfestigkeit zu reduzieren – bleibt unbeantwortet.

Mikropartikel sind frühe Marker der Entzündung41,42,43,44 und Thrombozyten Aktivierung45 und sind daher in vielen normalen Spendern erkannt. 19 folglich sind aktivierten Thrombozyten und Mikropartikel in Thrombozyten spenden. Es ist vernünftig zu vermuten, dass Patienten mit Fieber, d. h. eine vollständig aktivierten angeborenen Immunsystems, die zusätzliche Herausforderung, eine Transfusion von aktivierten Thrombozyten nicht tolerieren können. Allerdings sind Untersuchungen erforderlich, um diese Hypothese zu beweisen. Mikropartikel Screening kann lindern die derzeitige Unsicherheit über den Inhalt der Thrombozytentransfusionen und reduzieren die Komplexität der Behandlung von Patienten.

Das Verhältnis von aktivierten, nicht aktivierte Thrombozyten in einer Blutbank Krankenhaus richtet sich in erster Linie auf die Spender-Bevölkerung und in viel geringerem Maße auf Verkehr, Bestrahlung, Erreger Inaktivierung und andere Prozesse, die Thrombozyten Aktivierung im zunehmen Konzentrate. 19 Daten aus großen Krankenhausblutdepots in den Vereinigten Staaten hat gezeigt, dass die durchschnittliche Zusammensetzung des Inventars Thrombozyten 49 % aktiviert und 51 % nicht aktiviert (Bereich für aktivierten Thrombozyten: 38-62 %, persönliche Kommunikation). Wenn Blut Produktanbieter oder Krankenhausblutdepots wissen wollen, wieviele aktivierten und nicht aktivierten Thrombozyten-Konzentrate, sie produzieren oder erhalten, und ihr Inventar verwalten möchten, basiert auf Thrombozyten Aktivierung angedeutet durch Mikropartikel Inhalt, dies Protokoll kann für sie sinnvoll sein.

Basierend auf Thrombozyten Zusammensetzung eine Blutbank Krankenhaus in der Lage werden, direkte nicht aktivierte, homogene Plättchen für prophylaktische verwenden und aktiviert, heterogene Thrombozyten für den therapeutischen Einsatz. Thrombozyten-Screening kann Krankenhäuser, Nutzung des verfügbaren Lagerbestands zu maximieren die Patientenversorgung verbessert und verringert Kosten. Dieses Protokoll ist für Laborpersonal gedacht, die grundlegende Bedienung und Manipulation von Blutprodukten kennen.

Präsentiert hier ist eine Screening-Methode für Mikropartikel in Thrombozytentransfusionen, die routinemäßig angewendet werden können, um Krankenhausinventar Blutbank verwalten wenn Produktauswahl basierend auf Mikropartikel Inhalt gewünscht wird. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Durchführung und Auswertung von DLS für das Screening von gespendeten Thrombozyten zu skizzieren. Das beschriebene Protokoll befasst sich mit der häufig gestellte Fragen von nicht-invasiven Zugang zu Proben, Integration von Tests in der Blutbank Arbeitsablauf und Leistungsmerkmale.

Protocol

Das folgende Protokoll wurde in Übereinstimmung mit allen kanadische Blut-Dienstleistungen (CBS) Richtlinien durchgeführt. Freiwillige Stadtbezirksverwaltung, die ihre Spenden verwendet, diese Untersuchungen durchzuführen. Thrombozyten-Konzentrate wurden laut CBS Standardarbeitsanweisungen vorbereitet. Alle Leistungstests hier beschrieben wurde im Zentrum für Blut-Forschung an der University of British Columbia, Vancouver, Kanada mit institutionellen Research Ethics Board Genehmigung durchgeführt. 1. Qualitätskontrolle Durchführen einer Qualitätskontrolle mindestens einmal pro Prüfung Tag um den ordnungsgemäßen Betrieb des DLS-Systems zu überprüfen. Messen Sie die mitgelieferte Steuerung Perlen (50 nm Radius) nach den Anweisungen des Herstellers für den Einsatz. Kontrollfläschchen aus Kühlhaus abrufen und 15 min auf Zimmertemperatur erwärmen lassen. Die Perlen müssen auf Raumtemperatur vor dem Gebrauch equilibrate. Schalten Sie das DLS-System vor der Vorbereitung der Probe, so dass die 15 min Laser warm up-Periode bis zu dem Zeitpunkt, ist die erste Probe zum Testen bereit abgeschlossen ist. Sobald die Konsole gestartet ist, folgen Sie den Anweisungen auf dem Touchscreen einloggen und wählen die Option System-Test zur Messung der Kontrollprobe. Vortex mischen das Fläschchen für 10 s zu eine repräsentative Stichprobe zu gewährleisten. Füllen Sie eine Kapillare mit der Steuerelement-Perlen mit 100 µL festen Volumen Pipette, Pipettenspitze und Kapillare aus dem Testkit. Wenn der Test abgeschlossen ist, folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm das DLS-System.Hinweis: Die Kontrolle Bead Testergebnisse werden automatisch im Vergleich zu in Kontrolle Wulst Barcode-Etikett und einem PASS gespeicherten Informationen oder FAIL Benachrichtigung sowie Beispielinformationen sind auf dem DLS System Bildschirm am Ende des Tests angezeigt. 2. erhalten eine Probe aus einem Thrombozyten-Konzentrat Hinweis: Diese Schritte beschreiben den Prozess für die nicht-invasive Probenahme aus der Thrombozyten-Transfusion in der DLS testen Kapillare für die routinemäßige Thrombozyten Bestandsführung. Eine Übersicht ist in Abbildung 1dargestellt. Zubehör: tube Sealer, manuelle Rohr Stripperin, Schere und Splash-Schild. Entfernen Sie die Thrombozyten-Konzentrat aus dem ungeprüften Inventar. Erhalten der Stichprobe der Thrombozyten-Produkt entweder von einem ungenutzten Probenahme-Beutel (fahren Sie mit Schritt 2.3) oder ein Schlauch-Segment (fahren Sie mit Schritt 2.4 Wenn leer oder Schritt 2.5 Wenn nicht leer).Um den Beutel zu trennen verwenden Rohre oder Schläuche Segment eine Rohr-Versiegelung. Um das Rohr Schweißgerät bedienen, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers. Kurz, Klemmen Sie den Schlauch in eine genaue Position zwischen zwei beheizten Backen versiegelt werden. In einem handheld-Gerät, drücken Sie die geschmolzene Rohr zusammen und kühlen unter hohem Druck beim Betätigen des Hebels (die Dauer ist gekennzeichnet durch das grüne Licht) führt eine permanente, auslaufsichere Dichtung. Probenahme aus einem Beutel Mischen Sie den Inhalt des Beutels Thrombozyten gut durch sanfte Horizontalbewegung für 5 s (Kippen von Anfang bis Ende fünfmal). Öffnen Sie die Halterung auf dem Beutel. Der Beutel wird evakuiert und füllt sich von selbst. Es ist nicht notwendig, den Beutel vollständig auszufüllen, da nur 100 µL Probe für DLS Tests benötigt werden. Trennen Sie den Beutel aus dem Beutel durch Heißsiegeln der Verbindung Schlauch mit einem Rohr-Versiegelung. Fahren Sie mit Schritt 3 fort. Probenahme aus leeren Schlauch Stellen Sie sicher, dass die Thrombozyten Tasche Schläuche leer gelagert wurde und der Schlauch-Block ist immer noch vorhanden. Überprüfen Sie die Schläuche um sicherzustellen, dass gibt es keine erhebliche Menge an Thrombozyten-Konzentrat in den Schlauch. Wenn der Schlauch nicht leer ist, fahren Sie mit Schritt 2.5. Schließen Sie die Röhre Stripperin auf die Schläuche als in der Nähe des Schlauch-Blocks wie möglich durch Komprimieren die Griffe, um den Schlauch zwischen die Walzen quetschen. Hängen Sie die Tasche vertikal und halten Sie die Stripperin Griffe komprimieren. Während die Stripperin zu halten geschlossen, lassen Sie den Schlauch-Block. Ziehen Sie langsam die Stripperin hinunter den leeren Schlauch ermöglicht den Schlauch langsam hinter die Stripperin füllen. Weiter bis Abschnitt unterhalb der Abstreifer vollständig aufgeblasen hat oder die Stripperin in 1 Zoll vom Ende des Schlauches ist. Sobald der Haltepunkt mit der Stripperin erreicht ist, Gebrauch das Rohr Schweißgerät Hitze versiegeln die Schläuche 1 Zoll über die Stripperin. Lassen Sie die Griffe der manuellen Rohr Stripperin. Hitze Dichtung wieder 1 bis 2 Zoll oberhalb der früheren Dichtung Segment Tests erstellen. Das Test-Segment von Thrombozyten-Einheit abgeschnitten. Dieses Segment wird für DLS Tests verwendet werden. Probenahme aus Rohren, die nicht leer ist Hängen Sie die Tasche vertikal und lassen Sie den Schlauch-Block im Ort. Überprüfen Sie die Schläuche um festzustellen, ob es bedeutenderen festen Klumpen gibt. Wenn feste Klumpen vorhanden sind, über ihnen zu versiegeln, so dass sie in der Tasche entfernt werden können nicht. Schließen Sie die Röhre Stripperin auf die Schläuche als kurz vor dem verschlossenen Ende des Schlauches wie möglich. Bewegen Sie den Inhalt des Schlauches in die Tasche Streifen, durch Komprimieren die Griffe, um den Schlauch zwischen den Rollen und unter Beibehaltung der Klemmkraft quetschen die Rohr-Stripperin entlang den Schlauch auf die Tasche. Die Thrombozyten-Tasche aus der Aufhängehaken entfernen und vorsichtig mischen den Beutel für 5 s durch Kippen es von Anfang bis Ende fünfmal unter Beibehaltung der Stripperin geschlossen. Hängen Sie die Tasche vertikal unter Beibehaltung der Stripperin geschlossen. Ziehen Sie langsam die Stripperin hinunter den leeren Schlauch, so dass für den Schlauch langsam hinter die Stripperin füllen. Weiter bis Abschnitt unterhalb der Abstreifer vollständig aufgeblasen hat oder die Stripperin in 1 Zoll vom Ende des Schlauches ist. Sobald der Haltepunkt mit der Stripperin erreicht ist, Gebrauch das Rohr Schweißgerät Hitze versiegeln die Schläuche 1 Zoll über die Stripperin. Lassen Sie die Stripperin. Hitze Dichtung wieder 1 bis 2 Zoll oberhalb der früheren Dichtung Segment Tests erstellen. Abgeschnitten und den letzten Teil des Schlauches zu verwerfen. Das Test-Segment von Thrombozyten-Einheit abgeschnitten. Dieses Segment wird für DLS Tests verwendet werden. 3. füllen die Probe in der DLS testen Kapillare Mit einem Spritzer Schild und sauberen, trockenen Schere, schneiden Sie ein Ende des Beutels Schläuche oder Segment-Tests.Hinweis: Die Kapillare verwendet für DLS testen sollte sofort gefüllt werden. Füllen Sie die Kapillare mit dem Sampling-Tool (montierte 100 µL festen Volumen Pipette, Pipettenspitze und Kapillare) die Probe direkt aus dem geöffneten Beutel oder Schlauch-Segment in der Kapillare zu ziehen. Dichtung unten der gefüllten Kapillare drücken Sie sanft die gefüllte Kapillare in das Kapillarrohr Dichtungsmittel während der Anwendung eine sanfte Drehung und etwas Druck gegen das Fach. Trennen Sie die 100 µL festen Volumen Pipette und Tipp von der Kapillare, sicherzustellen, dass die Kapillare bleibt fest eingebettet in das Kapillarrohr Dichtungsmittel. Entfernen Sie die Kapillare aus dem Kapillarrohr Dichtstoff Fach, wischen Sie mit einem Isopropyl-Alkohol-Pad und sicherzustellen Sie, dass keine Luftblasen eingeschlossen sind, durch sanft streichen der Unterseite der Kapillare. Legen Sie die Kapillare in das DLS-System. 4. durchführen die DLS-test Wählen Sie die MP-Test-Option, einen neuen DLS-Test zur Messung des Mikropartikel-Inhalts einer Thrombozytenzahl Probe zu initiieren. Geben Sie die Beispielinformationen (Spende Identifikation Zahl (ISBT), Ablaufdatum Sammlung/Produktion und Produkt-Code) mit dem Barcodescanner oder manuell. Wenn keine Produkt-Code verfügbar ist aus dem DLS-System können die flüssigere Mitte Informationen zu extrahieren, wählen Sie manuell die entsprechenden flüssige Medium (für die meisten Plättchen Konzentrate wählen Sie Plasma aber für Proben, die Thrombozyten Additive Lösung (PAS), geben Sie die Prozentsatz der verbleibenden Plasma).Hinweis: Eine kleine Abweichung in der PAS-Prozentsatz von nominal 65 % einen kleinen Fehler in der Viskosität (automatisch berechnet, indem das DLS-System) bewirkt die minimal berechneten MP Radius aber nicht % MP betrifft. Legen Sie die Kapillare in das DLS-System, wenn Sie dazu aufgefordert, und starten Sie den Test. Wenn der Test abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe aus der Kapillare Halter und entsorgen der Verbrauchsmaterialien entsprechend nach Anlage Richtlinien. Entfernen Sie die Probe aus der Kapillare Halter und entsorgen der Verbrauchsmaterialien entsprechend nach den Richtlinien der Anlage. Tag die Thrombozyten-Tasche mit der Farbe für das Ergebnis, zum Beispiel orange für nicht aktivierte (homogene) mit % MP gleich oder unter 15 % und rosa für mit % MP über 15 % (heterogene) aktiviert. Abbildung 1 : Methode Übersicht. Übersicht über die Schritte für die routinemäßige Thrombozyten Bestandsführung in einer Blutbank Krankenhaus durchgeführt werden: Erlangung einer Probe aus einem Plättchen Konzentrat, laden die Probe in der Kapillare für DLS-Messung, Ermittlung Mikropartikel testen Durchführung der DLS und mit den gemeldeten Mikropartikel Content, aktivierte Thrombozyten zu identifizieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Representative Results

Durchschnittliche ZubereitungszeitDie Thrombozyten screening-Prozess mit einem DLS-System ist in Abbildung 1zusammengefasst. Thrombozyten sind zum Zeitpunkt des Eingangs des Blut-Lieferanten mit dem DLS-System getestet. Wie in Tabelle 1 beschrieben, ist die durchschnittliche Zubereitungszeit für geschulte Anwender 2 min 23 s während der Aufräumarbeiten und Posttest Arbeitszeiten sind 14 s und 46 s, beziehungsweise. Insgesamt dauert der durchschnittliche Benutzer 3 min und 23 s Handhabungszeit pro Test. Aktivität Aktive Zeit Walk-away Testzeit INSGESAMT DLS System vorbereiten 14 s Probenahme-Werkzeug zu montieren 28 s Segment zu erhalten 52 s Füllen Sie die Kapillare und starten test 49 s 5 min Aufräumarbeiten 14 s Tag und Inventar Thrombozyten-Tasche 46 s Gesamtzeit pro Probe benötigt 3 min 23 s 5 min 8 min 23 s Tabelle 1: aktive Tests Zeit Aufschlüsselung. Der Test selbst ist ein Spaziergang entfernt Test mit einer durchschnittlichen Dauer von 5 Minuten. Der durchschnittliche Benutzer dauert 3 min 23 s das DLS-System auf einen Test vorbereiten, erhalten eine Probe nach diesem Protokoll zu testen und markieren die Thrombozyten-Tasche. PräzisionDie Präzision der DLS-System wurden auf drei Ebenen der Mikropartikel, 0-7 %, 12-25 % und 28-75 %. Es ist klinisch relevante an % MP 3-75 %. Zwei Operatoren niedriger, mittlerer und hoher Kontrollproben auf 16 Betriebstagen auf zwei DLS-Systemen parallel getestet. Proben wurden in zweifacher Ausfertigung, aber in zufälliger Reihenfolge auf jedem Testtag getestet. Tabelle 2 fasst die im Gerät Präzision der DLS Messungen für Prozent Mikropartikel (% MP) bezogen auf Thrombozyten. Mikropartikel Inhalt Low Medium Hoch Meine % MP (%) 4.4 19.5 53,8 Standardabweichung (%) 1.8 2.6 5.8 LEBENSLAUF (%) 40,4 13.2 10.6 Tabelle 2: Prozent Mikropartikel (% MP) im Gerät Präzision. Bei sehr niedrigen Mikropartikel-Inhalte, die kleinen Plättchen % beitragen können erhöht MP was Variabilität für niedrige Mikropartikel zufriedene Beispiele. Tabelle 3 zeigt die im Gerät Präzision der DLS Messungen für durchschnittliche Mikropartikel Radius zwischen 50-550 nm. Mikropartikel Inhalt Low Medium Hoch Meine Radius (nm) 331 161 188 Standardabweichung (mm) 133 41 25 LEBENSLAUF (%) 40.1 25.2 13.5 Tabelle 3: im Gerät Präzision Mikropartikel Radius. Bei sehr niedrigen Mikropartikel Inhalt kleine Plättchen können dazu beitragen, Prozent Mikropartikel (% MP) wiederum erhöhte Variabilität für niedrige Mikropartikel zufriedene Beispiele. Tabelle 4 zeigt die Reproduzierbarkeit der Messungen der DLS für Prozent Mikropartikel (% MP). Mikropartikel Inhalt Low Medium Hoch Meine % MP (%) 4.4 29.2 53,6 Reproduzierbarkeit (%) 1.5 2.3 5 LEBENSLAUF (%) 35 11.8 9.4 Tabelle 4: Reproduzierbarkeit der dynamischen Licht Streuung (DLS) Messungen für Prozent Mikropartikel (% MP). LinearitätAbbildung 2 zeigt, dass DLS Ergebnisse linear sind, d.h., passen eine gerade Linie in Bezug auf die zugewiesenen Werte der Proben. Sieben Proben wurden mit unterschiedlichen Mikropartikel Inhalt erstellt. Proben mit hohen (MP7), niedrig (MP1) Mikropartikel Inhalt und passende Plättchen Konzentration wurden vorbereitet und gemischt in unterschiedlichen Verhältnissen zwischen Proben (MPX) erstellen. Proben wurden mit Durchflusszytometrie bereits19 und DLS beschrieben getestet und % MP Ergebnisse bei jeder Konzentration aufgetragen wurden als Eingang und Ausgang. Der Bestimmungskoeffizient erwies sich 0.985. Beispiele von DLS Histogramme für die niedrigen und hohen Mikropartikel Inhalte sind in Abbildung 3dargestellt. Die DLS-Ergebnisse wurden durch Durchflusszytometrie (Abbildung 3B) bestätigt. Abbildung 2 : Vergleich der Durchflusszytometrie und DLS Ergebnisse. Lineare Beziehung zwischen % MP bestimmt durch Flow Cytometry (Eingang) und DLS (Ausgang), die DLS Originaldaten aus den zwei Proben durch die offene Symbol ○ markiert in Abbildung 3dargestellt sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Mikropartikel Inhalt zwischen aktivierten und nicht aktivierten Thrombozyten zu unterscheiden. (A) DLS Ergebnisse von MP-Inhalten in aktivierten Thrombozyten (gestrichelte Linie) betrug 57 % gegenüber 4 % im nicht aktivierten Thrombozyten (durchgezogene Linie). Tests wurden durchgeführt, bei einer Messung Temperatur von 37 ° C, Plasma-Viskosität-Einstellung von 1,06 X10-3 Pa·s und Gesamtintensität Einstellungen zwischen 200-600 kHz. (B) Flow Cytometry Ergebnisse (wie zuvor beschrieben19) der gleichen Proben wie in (A); in der forward Scatter-Histogramme stellen P1 und P2 bzw. der MP und Thrombozyten Tore; für aktivierte Thrombozyten fiel (links) 76 % der Ereignisse in der MP-Tor im Vergleich zu 6 % für nicht aktivierte Thrombozyten (rechts). Der linearen Regressionsgeraden schlägt einen konstante relativen Beitrag von Hintergrundgeräuschen % MP Durchflusszytometrie zu immer höheren Ergebnissen führt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Spezifität/StörungenDie International Organization for Standardization (ISO) definiert analytische Spezifität als die Fähigkeit eines Messverfahrens zu erkennen oder nur die Messgröße zu messen, während andere Größen in der Probe vorhanden sind. Die analytische Spezifität der Mikropartikel Screening könnte von Erythrozyten (RBC) betroffen sein. DLS misst MP Inhalt bezogen auf Thrombozyten Inhalt. RBC könnte stören, da die Streuung Beitrag der RBC der Streuung von Thrombozyten, Beiträge enthalten ist Reduzierung des relative Beitrags der MP. Grenzwerte für den zulässigen Inhalt der RBC in Blutprodukten vorhanden sind; eine konservative Konvertierung der Schwelle empfohlen von AABB für zulässige RBC-Konzentration in Thrombozyten-Konzentrate-2 mL verpackt RBC in einer Einheit von Blutplättchen führte 8.0 X1010 Zellen/L (Annahmen: RBC-Volumen beträgt 8,5 X10-14L, Hämatokritwert des verpackten RBC ist 68 %, Thrombozyten-Einheit beträgt 200 mL). Die gemeldeten residualen RBC-Konzentrationen in verschiedenen Produkten liegen deutlich unter dieser Schwelle46. Drei verschiedene Spendern stiftete Thrombozyten und Erythrozyten (RBC) an zwei verschiedenen Tagen, als Anspruch auf drei unabhängigen Experimenten. Der ursprüngliche Inhalt der RBC in den Thrombozyten-Konzentrate (Referenzprobe) war 0,05 – 0,15 X109 Zellen/L mit einem Hemocytometer bestimmt. Fünf zusätzliche Proben wurden von Spick-in bekannten Größen der RBC in Aliquote der Thrombozyten-Konzentrat erstellt; RBC Zielwerte in diesen Proben wurden 1.0 5.0, 10, 40 und 80 X109 Zellen/L. Die Schwelle der Störungen der roten Blutkörperchen war ca. 1,0 X1010 Zellen/L (Abbildung 4), die auch mit dem Niveau korreliert bei der war das Vorhandensein von roten Blutkörperchen visuell erkennbar (Abbildung 5). Oberhalb dieser Ebene wurde % MP unterschätzt, was bedeutet, dass in visuell rot, die Proben enthalten RBC, anstatt Hämoglobin-die gemeldeten Mikropartikel Inhalte werden zu niedrig. Abbildung 4 : Lineare Beziehung zwischen % MP (DLS) und RBC Konzentration (Zellen/L). Erhöhung der RBC-Konzentrationen von 0,1 X109, 1,0 X109, 5.0 X109, 1,0 X1010, 4.0 X1010und 8.0 X1010 Zellen/L (von links nach rechts) aus 3 unabhängigen Experimenten (○ Experiment 1, ● Experiment 2, □ Experiment 3, sind für jedes Experiment lineare Regression Linien dargestellt). Über 1,0 X1010 RBC/L führt zur Unterschätzung der % MP. Visuelle Darstellung von RBC enthaltenden Proben ist in Abbildung 5dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5 : Visuelle Erscheinungsbild der RBC mit Proben. Rötung der Thrombozyten Proben mit RBC-Konzentrationen von 0,1 X109, 1,0 X109, 5.0 X109, 1,0 X1010, 4.0 X1010und 8.0 X1010 Zellen/L von links nach rechts. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. GenauigkeitGenauigkeit ist definiert als der Unterschied zwischen einer Einzelmessung Ergebnis und eine wahre Mengenwert der Probe zugeordnet. Dieser Messfehler enthält eine systematische Komponente geschätzt durch Messung Vorspannung und eine zufällige Komponente von einer Standardabweichung geschätzt. Somit ist die Genauigkeit der ein Messergebnis eine Kombination aus Richtigkeit und Präzision. Eine Perle standard wurde verwendet, um die Genauigkeit des DLS Tests zu bestimmen. Genauigkeit wurde in zwei Konzentrationen innerhalb von klinisch relevanten Bereich des Assays der MP 3-75 % bewertet. Referenz-Korn-Mischungen wurden verwendet, um Proben der bekannten Konzentrationen vorbereiten, denn Referenz Perlen eine bekannte Größe und Konzentration haben. Infolgedessen können Referenz Perlen gemischt werden, um Proben mit gewünschten Partikelgrößen und Konzentration zu erhalten. Standard-Polystyrol-Kügelchen mit einem 125 nm Radius wurden verwendet, um Mikropartikel darzustellen und Perlen mit 1,5 µm Radius dienten, Thrombozyten zu vertreten. Die Genauigkeit der Mikropartikel-Assay wurde mit Wulst Mischungen von ca. 20 % und 50 % MP Inhalt bewertet. Die Genauigkeit der gemessenen Partikel Radien war im Vergleich zu den Partikel-Radien dokumentiert auf Analysenzertifikate für die Referenz-Perlen wie in Tabelle 5dargestellt. 125 nm Perlen 1,5 µm Perlen Analysezertifikat Analysezertifikat 20 % MP 50 % MP 20 % MP 50 % MP Meine Radius 122.0 113,8 124,4 1.5 1.6 1.60 Std Dev 4.5 2,83 3.6 0,035 0,06 0,07 CV 3,60 % 2,48 % 2,89 % 2,20 % 3,74 % 4.05 % Genauigkeit 6,70 % 2,00 % 6,50 % 6,30 % Tabelle 5: Genauigkeit der Messungen der dynamischen Licht Streuung (DLS). Größenvergleich für DLS führt gegen Analysezertifikat für Perlen mit 125 nm Radius und 1,5 µm Radius in Mischungen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine dynamische Lichtstreuung Methode für Mikropartikel-Screening für die hohen Partikelkonzentrationen in biologischen Proben gefunden, wie z. B. Thrombozyten konzentriert sich optimiert. Die Methode der DLS ist von Natur aus standardisiert, um die Größe genau zu messen. Die relative Konzentration der Mikropartikel kann eine absolute Konzentration umgewandelt werden, wenn die Thrombozyten Konzentration bekannt ist und die Thrombozyten Peakfläche als Referenz Spitze19 dient. Als Thrombozyten Konzentrationen sind in der Regel mit Hämatologie Analysegeräte erhalten oder fließen Cytometers dieser Methoden können als Begleiter Technologien an Verteilerlisten.

Die Funktionalität des Systems der DLS ist versichert durch Kontrolle Perlen regelmäßig ausführen. Destilliertes Wasser kann gemessen werden, um sicherzustellen, dass Hintergrundgeräusche minimal ist. Handelsübliche Plättchen Normen können als MP-Negative Kontrollen und nach Zugabe von 125 nm Radius Perlen, als MP-positiv-Kontrolle analysiert werden. Innerhalb der biologischen Bereich der MP-Konzentrationen von Interesse sind die Verfahren praktisch und schnell als Teil der Blutbank-Routine durchführen.

Im Gegensatz zur Durchflusszytometrie basiert diese Methode nicht auf dem Vergleich der Streuung Intensitäten von Teilchen sondern die Geschwindigkeit ihrer Brownsche Bewegung. So Exosomen auch trotz ihrer geringen Größe erkannt werden und von MP gesondert ausgewiesen.

Die Grenzen dieser Methode entworfen als Screening-Instrument, und beziehen sich auf seine Unfähigkeit zur Unterscheidung verschiedener Arten von Mikropartikeln. Gibt es mögliche Verbesserungspotenzial, wenn zusätzliche Isolierung Schritte verwendet werden; Proben konnte getestet werden, bevor und nachdem die spezifischen Entfernung von Mikropartikeln durch Antikörper magnetischer Wulst Erfassung gekoppelt. Darüber hinaus kann nicht davon ausgegangen werden, dass alle gefundenen Mikropartikel sind Zelle abgeleitet, weil Chylomikronen gegründet Hyperlipidämie47,48 und kleine Bakterien oder Viren6 auch im Bereich von Mikropartikel gemeldet werden. Jedoch gibt es andere Sicherheitsmaßnahmen innerhalb der Blut-Versorgungsmaterial zu stark Lipämische oder kontaminierte Thrombozyten Blutbank Krankenhausinventar eingeben.

Die Auswahl der Antigerinnungsmittel in der Probe beeinflusst das Ausmaß der Thrombozyten Aktivierung und somit die MP Inhalt49. Dieser Faktor muss für Vergleiche verschiedener Produkte berücksichtigt werden. Darüber hinaus wirken sich Austausch von Plasma mit MP frei aufgehängt Medien wie PAS der MP-Inhalt und die Schwelle für die Bestimmung der Heterogenität-wenn nur noch etwa ein Drittel des ursprünglichen MP-Inhalts innerhalb des verbleibenden Plasmas im Konzentrat ist ein entsprechend zeigt die Untergrenze MP Inhalt das gleiche Maß an Thrombozyten Aktivierung wie 100 % Plasma. Prozentuale MP ist der MP-Gehalt bezogen auf Thrombozyten. Es wurde bereits berichtet, dass die durchschnittliche Thrombozytenzahl PAS Produktes niedriger war, so dass die durchschnittliche % MP noch 9,5 %19war. Die Schwelle von % MP für PAS Thrombozyten in den USA lizenziert ist derzeit auf 10 % festgelegt.

Während die primäre Quelle von MP in Thrombozyten-Konzentrate der Spender ist, Prozesse, die Stress, Blutplättchen verursachen werden den verstärken MP je nach Anfälligkeit der Plättchen zu betonen-Thrombozyten bereits stark aktiviert, kleinere Stressoren wie verlängerte Haltbarkeit, Erreger Inaktivierung, waschen, könnte Bestrahlung oder Fernverkehr zu deutlichen Anstieg MP Inhalte führen. Keiner von diesen Stressoren haben gezeigt, dass homogene, nicht aktivierte Thrombozyten19erheblich beeinträchtigen. Darüber hinaus sollte Aufmerksamkeit auf das Potential für Veränderungen in der Zusammensetzung der Probe innerhalb der Kapillare bezahlt wenn nicht sofort nach der Zubereitung (Abschluss von Schritt 3 dieses Protokolls) getestet.

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Bestimmung der Zusammensetzung der Partikel in Thrombozytentransfusionen und Mikropartikel als Biomarker der Thrombozyten Aktivierung verwenden. Die Thrombozytentransfusionen sind als entweder nicht aktiviert (Orange) markiert oder aktiviert (rosa) basierend auf einem Mikropartikel prozentuale Schwellenwert von 15 %. Die Schwelle von 15 % MP für Thrombozyten in 100 % Plasma wurde empirisch bestimmt alsder Durchschnitt 66-Perzentil aus mehreren Standorten .

Thrombozyten-Inventar-Management basierend auf Routine Mikropartikel screening mit DLS soll Patienten Pflege und Laufwerk Kosteneffizienz zu verbessern, indem nicht-immunen Thrombozyten Feuerfestigkeit zu verhindern. Die Umsetzung der DLS-System für das Screening von Thrombozyten Taschen wird dem Benutzer nicht aktivierte Thrombozyten zu Patientengruppen mit einem Risiko für die Entwicklung von Thrombozyten Feuerfestigkeit direktesten ermöglichen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Blutspender und das Personal im kanadischen Blut Netzwerk Dienstleistungszentrum für angewandte Entwicklung für Sammlung und Produktion der Thrombozyten-Einheiten, die in dieser Studie verwendet. Wir anerkennen die Kanada-Stiftung für Innovation und Michael Smith Stiftung für Gesundheitsforschung für Infrastrukturfinanzierung im UBC Zentrum für Blut-Forschung. Die Publikation wurde von LightIntegra Technology Inc., Hersteller von ThromboLUX finanziert.

Materials

ThromboLUX-M LightIntegra Technology Inc.  LPN120 DLS System
ThromboSight Software LightIntegra Technology Inc.  LPN124 DLS analysis software
Capillaries LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) LPN065 Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated
MiniPet  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) LPN082 100 µL fixed volume pipette for sampling  
MicroFlex 1-200 µL Pipette tips LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) LPN080 Pipette tips for sampling
Critoseal  LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) LPN075 Capillary Tube Sealant
Dukal Alcohol Pad or equivalent LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) LPN085 Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol)
Control beads, 50 nm radius LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) LPN128 Control beads
Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm PolySciences Inc. 64060 Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm PolySciences Inc. 64014-15 Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 – 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water
Genesis BPS RapidSeal II or equivalent Genesis BPS 428-SE640 Tube sealer
Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent Fresenius Kabi 6R4452 Manual tube stripper
Biohazard Shield – Cell Counter or equivalent CardinalHealth S1389-75 Splash Shield
Corning LSE Vortex Mixer or equivalent Corning Incorporated 6775 Vortex mixer
FACSCanto II Flow cytometer  with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent BD Biosciences 338960 Flow cytometer
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Millar, D., Murphy, L., Labrie, A., Maurer-Spurej, E. Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions. J. Vis. Exp. (131), e56893, doi:10.3791/56893 (2018).
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