Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto
Summary
La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.
Abstract
La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, manteniendo una barrera mecánica al mundo exterior. Además, queratinocitos juegan un papel esencial en la iniciación, mantenimiento y regulación de la respuesta inmune epidérmica por ser parte del sistema inmune innato responde a los estímulos antigénicos de una manera rápida y no específica. Aquí, describimos un protocolo para el aislamiento de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta y demostrar que estas células responden a la diferenciación terminal inducida por calcio, medida por un aumento de expresión de la diferenciación marcador involucrin. Además, mostramos que los queratinocitos aislados responden a la activación de vías de señalización intracelular inducida por IL-1β como es medido por la activación de la vía de p38 MAPK. Tomados en conjunto, se describe un método para el aislamiento y cultivo de keratinocytes humanos primarios de la piel adulta. Porque los queratinocitos son el tipo celular predominante en la epidermis, este método es útil para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea in vitro.
Introduction
La piel es el órgano más grande del cuerpo humano y sirve como una barrera protectora contra el medio ambiente externo. La piel se compone de dos capas principales: la dermis y la epidermis, donde la epidermis constituye la capa más externa de la piel. El tipo de célula más abundante en la epidermis es keratinocytes que comprende más del 95% de la masa1,de célula2. Los queratinocitos se mantienen en distintas etapas de diferenciación de la epidermis y se organizan en estratos basals, espinosas, granuloso y cornified que corresponden a etapas específicas de diferenciación3. La función principal de los queratinocitos es proporcionar la integridad estructural de la epidermis, produciendo una barrera intacta al mundo exterior.
Los queratinocitos también representan la primera línea de defensa contra patógenos en la piel y por lo tanto juegan un papel importante en la respuesta inmune innata4,5. Exposición de los queratinocitos a los estímulos externos conduce a la activación de vías de señalización intracelular y posteriormente, producción de un número de varios mediadores inflamatorios como citoquinas, quimiocinas y péptidos antimicrobianos. Estas proteínas derivados de queratinocitos participan en la respuesta inflamatoria por reclutar y activar las células inmunes tales como células dendríticas, neutrófilos y específicos6,de las células de T7. Así, porque los queratinocitos desempeñan un papel crucial en numerosos procesos biológicos, el fundamento de la técnica presentada aquí fue generar un modelo en vitro para estudiar la biología de la piel. Cultivos de queratinocitos primarios obtenidos de prepucio neonatal se utilizan a menudo para estudiar la piel biología8,9. Sin embargo, con la técnica descrita aquí, queratinocitos de ambos sexos se obtienen dando por resultado una mayor diversidad biológica de las células.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento y la generación de keratinocytes humanos primarios de piel de adultos, incluyendo el mantenimiento y la congelación de los queratinocitos. El objetivo general de este método es generar keratinocytes humanos primarios que pueden utilizarse como modelo para estudiar biología cutánea in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos cómo fácilmente aislar queratinocitos humano primario de piel adulto y su cultivo en vitro. Este modelo puede tener un amplio uso para la investigación de Biología de la célula epidérmica y puede ser útil para los investigadores interesados en el estudio de enfermedades cutáneas.
Algunas de las ventajas del protocolo descrito aquí es que en contraste con queratinocitos de prepucio neonatal de los varones recién nacidos sometidos a la circuncisión, keratin…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea agradecer a Annette Blak Rasmussen y Kristine Moeller por su soporte técnico
Materials
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005-034 | Cell culture medium |
| KSFM supplements | ThermoFisher Scientific | 37000-015 | Supplements for KSFM |
| DPBS | ThermoFisher Scientific | 14190-144 | DPBS without Calcium and Magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Dimethyl sulfoxid |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | Cell culture medium additive |
| Sterilization filter | Sartorius | 16534 | Syringe filter with a pore size of 0.2 µm |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T7409 | Used to trypsinize cells |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | – |
| RPMI-1640 | ThermoFisher Scientific | 61870-010 | – |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 16000044 | Used to inactivate trypsin |
| Forceps | – | – | Forceps from any company can be used |
| Scissors | – | – | Scissors from any company can be used |
| Scalpel | Swann Morton | 0501 | Scalpels from any company can be used |
| 70% ethanol | – | – | – |
| Gauze pads | NOBAMED | 875420 | Gauze pads from any provider can be used |
| Foot planer | Credo Solingen | 1510 | Foot planer from any provider can be used |
| Petri dishes | TPP | 93100 | Petri dishes from any provider can be used |
| Metal filter | – | – | In-house 1 mm hole size metal filter |
| 75 cm2 culture flasks | NUNC | 156499 | – |
| 150 cm2 culture flasks | TTP | 90151 | – |
| 0.05% Trypsin-EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | Used to trypsinize cells when passaging |
Referencias
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