代谢图谱: 定量酶化学和组织化学法测定脱氢酶在细胞和器官中的活性

本议定书遵循学术医学中心医学伦理审查委员会关于使用人体材料的指导方针。 1. 细胞或组织切片的制备 细胞 胰蛋白酶处理细胞从培养皿使用1毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA 5 分钟在37°c 在10毫米培养皿和带来细胞在37°c 悬浮5000万细胞或 mL, 取决于细胞的大小。 将细胞悬浮液的200µL 在显微镜下, 使用 cytospin 漏斗在 cytocentrifuge 20 x g 处, 室温5分钟。 在室温下风干 cytospins 24 小时。这不影响脱氢酶活性。5 组织切片 根据道德许可, 从病人或动物身上提取组织。10毫米3的组织足以进行多项实验。 把纸巾放到小通风的2毫升塑料瓶中, 并把含有该片组织的瓶子冷冻在液氮中。 将含有组织片的小瓶存放在−80°c, 直到进一步加工。 使用一种称为最佳切削温度 (OCT) 的凝胶介质, 将组织样本装在一个卡盘上, 它可以快速冻结到-20 °c 到-25 摄氏度, 这样水就无法形成晶体。 使用恒温器切割和首先修剪块到所需的水平 (理想的一半宽度的显微镜玻璃幻灯片, 例如5毫米 x 5 毫米). 切片时, 使用刷子和防卷板防止部分卷曲向上。 以缓慢而恒定的速度将组织样品切成6-10 µm 厚的切片 (每节1秒)。当一个截面被正确切割, 它仍然是平的切片刀下的反卷板。 在显微玻璃幻灯片上捡起1-3 节, 然后在−80°c 储存直到使用。所准备的节数取决于组织样本的大小和所需的截面厚度。 2. 酶历史/化学可溶性脱氢酶 准备反应缓冲器。 准备100毫升磷酸盐缓冲液的正确 ph 值 (请参阅表 1; 每种酶具有最佳的 ph 值, 其活性最高)。例如, 0.1 M 的混合解决方案2PO4 (酸性) 和 0.1 M NA2HPO4 (基本), 直到有正确的 pH 值的缓冲区。 将聚乙烯醇 (pva) 重18克, 放入烟罩下的磷酸盐缓冲液中, pva 是灰尘和有毒的。 将18% 瓦特/v PVA 在磷酸盐缓冲器中溶解100摄氏度, 通过升温缓冲au 贝恩玛丽(把玻璃瓶放在沸水中) 搅拌直到 PVA 完全溶解。解决方案将是透明的, 然后, 由搅拌引起的小气泡。它通常需要15分钟的聚乙烯醇溶解。注: 18% 瓦特/v PVA 在磷酸盐缓冲器是粘性的, 可以转移到15毫升反应缓冲管使用宽吸管。短期贮存18% 瓦特/v PVA 在磷酸盐缓冲应发生在≥40°c 和长期储存 (最多2周) 在≥60摄氏度。250µL 18% 瓦特/v PVA 在磷酸盐缓冲通常需要 cytospin 准备, 而500µL 是需要的一个组织部分。 准备四氮唑盐 (nitroBT) 溶液。对于每1毫升的孵化培养基, 需要40µL 的 nitroBT 溶液, 包括5毫克的 nitroBT (黄色粉末) 溶解在20µL 甲基酰胺 (DMF) 和20µL 乙醇, 这将是一个淡黄色透明的解决方案。注: 由于 nitroBT 的稳定性是所有必要试剂中最低的, 所以建议先准备 nitroBT 的溶液, 然后将 nitroBT 溶解到反应介质中。 在短时间内 (~ 十年代) 使用本生燃烧器将 nitroBT 在 DMF 和乙醇中溶解。在加热过程中摇动瓶子, 不要在火焰中留下瓶子太长, 以防蒸发。 做10% 额外的 nitroBT 溶液, 以使 DMF 和乙醇在溶解过程中蒸发。 屏蔽电子载体吩 methosulfate (pms) 或 (1-甲氧基)-吩 methosulfate (mPMS), 和孵化媒体含有 m (PMS) 从直接光通过包装锡纸周围的玻璃储存瓶。 通过在蒸馏 H2O 中溶解它们, 根据表 1准备试剂解决方案。有些试剂很快就会消失, 所以在实验之前尽快准备好。将试剂解决方案保留在冰上或摄氏4摄氏度, 直到使用. 准备孵化介质, 如表 1中所示, 并在每步经过温和搅拌后融汇解决方案。在搅拌的同时, 要避免在孵化介质中产生气泡, 不断搅拌, 使刮刀保持在孵化培养基的表面下方。 孵化培养基在组织切片中的应用 在免疫组化孵化室中, 用 cytospins 或组织切片附加在37°c 的预温显微镜, 15 分钟. 用温水浸泡在免疫组织化学孵化室的底部, 以保持恒温。孵化器。 小心地打破或看到了巴斯德吸管在过渡从狭窄到宽的部分。常规的巴斯德吸管太窄, 无法吸入粘稠的孵化培养基, 所以这一步需要使巴斯德吸管足够宽, 以培养培养基的渴望。 应用250-500 µL 适当的孵化培养基的每一个细胞的准备或组织切片上的显微镜幻灯片使用的广泛部分的巴斯德吸管。 使用吸管尖端均匀地分散培养培养基。在孵化培养基中忽略小气泡, 因为它们会漂浮到表面, 不会干扰在细胞制备或组织切片上的酶反应。 根据酶动力学及其在特定细胞制剂中的表达, 在显微镜下的37°c 孵化器 (例如组织培养孵化器) 上孵化细胞制剂或组织切片组织 (表 1)。保持免疫组化孵化室的盖子保持湿润环境, 防止反应缓冲干燥。 清洗显微镜幻灯片 在组织上轻拍多余的孵化培养基。 机械冲洗的孵化培养基从显微镜幻灯片在60°c 磷酸盐缓冲, pH 值 5.3, 通过移动显微镜在缓冲区上下滑动。这停止了酶的反应。 通过保持60°c 磷酸盐缓冲液, pH 5.3 为20分钟, 清洗显微镜切片。 机械清洗显微镜幻灯片在60°c 自来水。 在60摄氏度自来水中保持20分钟, 以洗涤显微镜的幻灯片。 让水和幻灯片降温通过慢慢地混合室温自来水与60°c 自来水在1分钟的过程中。 在室温蒸馏水中执行最后的机械洗涤步骤。 将染色的 Cytospins 或组织切片放在显微镜下的幻灯片上 预热一张幻灯片, 温度在50-60 摄氏度。 仔细干燥后侧的显微镜幻灯片使用纸巾, 并把他们放在幻灯片上的温暖, 以干的显微镜幻灯片的顶部一侧。 当幻灯片干燥时, 用甘油果冻安装培养基和盖玻片将细胞制剂或组织切片放在显微镜下的幻灯片上。 保存细胞制剂或组织切片显微镜幻灯片在黑暗中的冰箱在4摄氏度或立即进行图像采集。 3. 图像采集 记录图像与科学的单色 CCD 相机具有足够的动态范围 (至少8位, 但最好10位或12位), 固定增益和线性响应。 选择一个适当的目标 (20 x-63 x 为 cytospins 和10-63X 的组织切片)。 通过缩小场膜片来减少眩光, 使其比视野稍大。 使用单色光, 在 formazan 沉淀7的 isobestic 波长附近应用一个 10 nm 宽带通推理过滤器, 并与红外阻塞过滤器 (请参阅材料表) 进行组合。注: nitroBT 的最大 isobestic 吸光度为 585 nm。 优化光照以确保相机的整个灰度范围 (即,设置光照水平, 以便在录制空白显微镜幻灯片时不过度暴露而实现最大光照)。 校准被测量的灰色水平到已知的吸光度 (或光学密度 [OD]) 值。为此, 捕获至少10个不同步骤的灰度图像, 其中有已知 OD 值的校准幻灯片或步进片 (见步骤 4.1.1), 无论是商用 (参见材料表), 还是测量自定义的灰度楔形步进板, 由densitophotometer 并使用结果将测量的灰色值校准为已知的吸光度值。 捕获显微照片细胞或组织部分的兴趣。 4. 图像分析 在图像分析之前, 校准 ImageJ 软件以进行吸光度测量。 测量具有已知 OD 值的校准滑块或步进片中至少10个校准区域的显微照片的吸光度 (OD) 和已知的吸光度参数。在 ImageJ 中, 使用 “分析→度量值” 菜单或 Ctrl + M 热键测量选定区域。 通过分析→校准开始吸光度校准程序。选择功能 “Rodbard (NIH 图像)”。在打开的窗口的左列中, 在4.1.1 中执行的校准滑块/步进片的每一步的灰度测量结果已经存在。如果没有, 请从 ImageJ 结果屏幕复制它们。在右列中, 输入与已校准的步骤片所收到的证书上打印的每个相应的已知吸光度值。刻度盒 “全局校准” 和 “显示情节”, 并按 “确定”。 对于质量控制, 请确保 Rodbard 函数的 R2为 > 0.99。如果是 < 0.99, 检查校准幻灯片是否被正确拍照和测量, 以及是否正确输入了已知的吸光度参数。 ImageJ 现在校准, 直到你关闭程序 (因此, “全球校准”)。对于吸光度测量, 校准的 ImageJ 会话总是将观察到的吸光度方法转换为介于0和1之间的值, 其中0和1分别为零和完全吸光度的渐近线。 对于 cytospins, 请随机选择 > 100 个单元格。对于组织节, 请在所有节中选择固定长度和宽度的一个或多个感兴趣的字段。 在显微照片上投射一个光栅, 以帮助不公正的细胞选择。在 ImageJ 中, 通过插件在图像上投影一个网格→分析→网格菜单。 在 ImageJ 中, 使用椭圆工具选择单个单元格, 并使用矩形工具选择组织区域。 测量所选细胞或组织区域的吸光度和面积。在 ImageJ 结果电子表格中, 光密度和面积被称为 “平均值” 和 “面积”。注意: 细胞或组织区域的总吸光度 (如果你选择了几个不同大小的组织区域) 等于所有分离的像素 absorbances 的总和。如果一个细胞在1000年像素的图像, 那么总吸光度由 1000年 absorbances 的总和和平均吸光度由总 absorbance/1000 给出。此过程还避免了分布错误。 确定 > 30 细胞或组织区域的平均总吸光度从控制滑块 (s), 其中包含一个样本, 暴露在控制孵化培养基缺乏基质, 但在存在的辅助因子。该控制吸光度用于控制所用显微切片、安装介质、遮盖滑移或显微镜引起的非特异酶活性染色和吸光度制品。 减去与余子相同浓度 (但不同浓度的基质和/或抑制剂) 接触的样品的所有吸光度测量的平均控制吸收量。这给出了细胞或组织区域的校正总吸光度。 用学生的 T 检验或单向方差分析测试的平均校正总 absorbances 进行统计学比较, 这取决于你的实验设计。 Formazan 吸光度可以转化成酶活性 (每毫升µmol 转化的基质) 使用兰伯特-啤酒的定律: c = A/(є×d), 其中 c 是 Formazan 在反应介质中的浓度, A 是校准后 ImageJ 中的测量吸光度;є是 formazan 的消光系数 (16.000 在585毫微米)8和 d 是光的旅行距离, 等于平均细胞厚度或名义切片厚度 (6-10 µm 在这个协议)。注: 干燥后, 组织断面厚度从公称断面切割厚度减少 50%, 但在上述计算中没有反映, 因为公称断面切割厚度与生物学上最相关。通过共聚焦显微镜或广域显微术, 可以确定 preparates 细胞的平均厚度和球体尺寸, 并可在别处找到协议。9,10