Zenginleştirme bakteriyel lipoproteinler ve kütle spektrometresi tarafından yapısal kararlılık için N-terminal Lipopeptides hazırlanması
Summary
Bakteriyel lipoproteinler yöntemi bölümleme bir iyonik olmayan yüzey aktif faz kullanarak zenginleştirme doğrudan TLR deneyleri kullanımda veya diğer uygulamalar için tanımlanır. Daha fazla adımlar için yapısal karakterizasyon N-terminal tryptic lipopeptides hazırlamak için kütle spektrometresi tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Abstract
Lipoproteinler bakteri hücre zarf önemli bileşenleri ve memeli doğuştan gelen bağışıklık yanıtının güçlü harekete geçirmek vardır. Hücre fizyolojisi ve İmmünoloji öneme rağmen çok roman lipoprotein formları, nasıl onlar sentez ve ana bilgisayar dokunulmazlık çeşitli formları etkisi hakkında keşfedilmeyi kalır. Lipoproteinler üzerinde kapsamlı çalışmalar etkinleştirmek için bu iletişim kuralını bakteriyel lipoprotein zenginleştirme için bir yöntemi açıklar ve N-terminal tryptic lipopeptides hazırlanması için lazer matris destekli yapısal kararlılık desorption iyonlaşma-uçuş süresi Kütle spektrometresi (MALDI-TOF MS). Bölümleme yöntemi lipoprotein çıkarma ve zenginleştirme bakteriyel hücre zar için kurulan bir Triton X-114 faz genişletilmesi, protokol lipoprotein verim artan lipoprotein olmayan kirletici kaldırmak için ek adımları içerir ve saflık. Lipoproteinler Toll benzeri reseptör (TLR) deneyleri içinde yaygın olarak kullanıldığından, bu ilk N-terminal yapı MALDI-TOF Bayan işbu tarafından karakterize etmek için önemlidir, bir yöntem N-terminal zenginleştirilmiş konsantre hidrofobik peptidler yalıtmak için sunulmuştur lipopeptides Sodyum Lauryl Sülfat Poly-akrilamid jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından ayrılmış MALDI-TOF MS/MS. lipoproteinler ile doğrudan analiz için uygun nitroselüloz membran için transfer, situ ile sindirmek tripsin, ardışık olarak kutup tryptic peptidler kaldırmak için yıkanmış ve nihayet kloroform-metanol ile eluted. Yıkama çözümlerinden daha kutup trypsinized peptidler MS ile birleştiğinde, bu yöntem hem lipoprotein tanımlamak ve onun N-terminus bir tek denemede karakterize yeteneği sağlar. Kasıtlı sodyum adduct oluşumu da bir araç olarak daha fazla yapısal olarak bilgilendirici parçalanma spectra tanıtmak için istihdam edilebilir. Sonuçta, lipoproteinler zenginlik ve N-terminal yapılarını belirlenmesi daha kapsamlı çalışmalar bakteriyel proteinlerin her yerde bu sınıf izin verir.
Introduction
Bakteriyel lipoproteinler bu hücre membran yüzey küresel protein etki alanına tutturur bir korunmuş N-terminal lipid-modified Sistein ile karakterizedir. Evrensel bir tipik genom1içinde tüm hücresel genlerin % 2-5 oluşturan bakterilerde dağıtılır. Lipoproteinler kritik hücresel süreçler, besin alımı, sinyal iletim de dahil olmak üzere çok çeşitli rollerde oynamak, derleme protein kompleksleri ve korumak hücre zarf yapısal bütünlük2. Patojen bakteriler, lipoproteinler virülans faktörleri3,4hizmet vermektedir. Enfeksiyon sırasında N-terminal lipopeptides Toll benzeri reseptör (TLR) 2 tarafından tanınması işgal patojenler kaldırmak için doğuştan gelen bir bağışıklık yanıtı kışkırtırız. N-terminal asilasyonu durumuna bağlı olarak, lipoproteinler genellikle alternatif TLR2 heterodimeric kompleksleri tarafından kabul edilmektedir. TLR2-TLR1 N-acylated lipopeptides, TLR2-TLR6 bağlar ücretsiz lipopeptide α-amino termini süre tanır. Bir kez bağlı, sinyal yolları proinflamatuar sitokinler3,4salgılanmasını ikna etmek için gidiyor.
Bu daha önce triacylated, devamsızlık veya varlığı bir Amid bağlı yağ asidi korunmuş N-terminal sistein kalıntıları üzerinde farklı olduğunu diacylated ve bu gram-negatif bakteri gram-pozitif bakterilerden lipoproteinler olduğunu düşünüldü. Bu varsayım gram-pozitif genleri ormanda, triacylated lipoproteinler5formları Ayagin Gram-negatif N-açil transferaz için sıra orthologs eksikliği ile desteklenmiştir. Ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda gram-pozitif Firmicutes o-sizlik çekmek- ormandalipoprotein triacylation yanı sıra peptit, lyso ve N –asetil formları6,7 olarak adlandırdığı üç roman N-terminal lipoprotein yapıları, ortaya koymuştur ,8. Bu bulgular yanı sıra çeşitli formları bu roman lipoproteinler nasıl yapılır hakkında temel soru ve ne fizyolojik amacı veya avantaj vermek mümkün henüz için-olmak-keşfedilen lipoprotein formları hakkında sorular yükseltmek. Ayrıca, onlar açıkça lipoprotein yapısı tahmin etmek genomik geçerli yetersizliği gösteriyor. Nitekim, son zamanlarda lipoprotein N-asil Transferazlar, edebiyat, Enterococcus faecalistir ve lyso-form lipoproteinler9yapan Bacillus cereus adı verilen yeni bir sınıf tanımlanan. Bu deneysel olarak onların son derece hidrofobik doğa ve moleküler yapılarını karakterize etmek sınırlı yöntemleri nedeniyle zor olabilir lipoprotein yapısını doğrulayın gerektiğini belirtir.
N-terminal yapısal kararlılık yanı sıra konak immün yanıt lipoprotein indüksiyon çalışmaları kolaylaştırmak için biz birkaç daha önce açıklanan protokol bakteriyel lipoproteinler arındırmak ve N-terminal tryptic hazırlamak için adapte olması lipopeptides MALDI-TOF MS6,10,11,12göre analiz için. Lipoproteinler bölümleme yöntem, bulaşıcı olmayan lipoproteinler kaldırmak ve lipoprotein verimi artırmak için en iyi duruma getirme ile kurulan bir Triton X-114 (bundan böyle yüzey aktif veya TX-114 olarak anılacaktır) faz kullanarak zenginleştirilmiş. Bu lipoproteinler TLR deneyleri doğrudan kullanım için veya daha fazla arıtma tarafından SDS-sayfası için uygundur. MALDI-TOF ms’ye aktarımı lipoproteinler nitroselüloz membran bir iskele verimli situ tripsin sindirim için yıkama sağlar ve son derece sonuçlanan membran yüzey sonraki elüsyon N-terminal lipopeptides saf. Nitroselüloz örnek işleme kolaylaştırmak ve integral membran proteinleri13,14yanı sıra lipoproteinler9,10 son derece hidrofobik peptidler için sıra kapsama geliştirmek için gösterilen . Yöntem böylece ara yıkama çözümleri aynı anda kararlılıkla N-terminal yapısal bir tek denemede güvenilirliği yüksek protein tanımlama için analiz edilebilir polarite üzerinde dayalı peptidler parçalanması ek avantajı vardır . Bu iletişim kuralı benzersiz özellikleri kasıtlı sodyum adduct oluşumu sırasında MS/MS, N– asilasyonu devlet yapısal tayini yardım dehydroalanyl iyonları doğru üst iyon parçalanma teşvik etmek. N-terminus lipoproteinler TLR tanınması ile ilgili her iki en değişken ve anahtar özelliğidir. Birlikte ele alındığında, bu iletişim kuralı, lipoproteinler, arıtma ve yapısal kararlılık MALDI-TOF kolayca adapte deneme genel amacı bağlı olarak MS tarafından bireysel aşamaları ile üzerinde yoğun ve tekrarlanabilir çalışmalar sağladı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada protokolünü lipoprotein karakterizasyonu iki ayrı aşamada açıklar: zenginleştirme TX-114 tarafından aşama MALDI-TOF MS tarafından bölümleme ve yapısal kararlılık. TX-114 emme sırasında ek Santrifüjü zenginleştirilmiş lipoproteinler vermeye aseton yağış tarafından takip bu işlem sırasında çökelti bulaşıcı proteinlerin kaldırır. Hücre her hazırlık-15 mL değer ölçeğini sınırlayarak, çeşitli örnekleri kolaylıkla paralel olarak işlenir ve istenirse, protokol sonunda havu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Meredith laboratuarında araştırma başlangıç sa¤lanan Kaynak Eberly College of Science tarafından (Pennsylvania State Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir. Uzman teknik danışmanlık ve ekipmana Penn State proteomik ve kütle spektrometresi çekirdek tesis, University Park, PA, kitle spektrometrik Analizi yapılacağı yeri için Dr Tatiana Laremore teşekkür ederiz.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
Referencias
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
