細菌のリポタンパク質と質量分析法による構造決定のための N 末端 Lipopeptides 準備の充実

細菌のリポタンパク質は、節約された N ターミナル脂質修飾システイン細胞膜の表面に球状タンパク質ドメインをアンカーによって特徴付けられます。彼らは普遍的に、典型的なゲノム¹内のすべての細胞遺伝子の 2 ~ 5% を構成する細菌で配布されます。リポタンパク質はさまざまな養分吸収、シグナル伝達、細胞プロセスで重要な役割を再生、タンパク質複合体の維持およびアセンブリ細胞エンベロープ構造健全性²。病原性細菌のリポタンパク質は病原性因子^3,4として機能します。感染中は、Toll 様受容体 (TLR) 2 によって N 末端 lipopeptides の認識は侵入病原体を削除する自然免疫応答を誘発します。N 末端のアシル化状態に応じてリポタンパク質一般に代替 TLR2 ヘテロ二量体複合体によって認識されます。TLR2 TLR1 は、TLR2 TLR6 バインド無料リポペプチド α-アミノ酸テルミニ間の N アシル化 lipopeptides を認識しています。炎症性サイトカイン^3,4の分泌を誘発するのにバインドされた後、シグナル伝達経路は収束します。

以前、グラム陽性細菌由来のリポ蛋白だったおよびグラム陰性菌からの diacylated triacylated、節約された N ターミナル システイン残基のアミド結合脂肪酸の有無が異なると考えた。この仮定は、Lnt、triacylated リポ蛋白⁵を形成するグラム陰性 N アシル転移酵素にグラム陽性菌ゲノムのシーケンスのオルソログ遺伝子の欠如によって支えられました。しかし、最近の研究は明らかにグラム陽性フィルミクテス門その欠如lntでリポ triacylation として、ペプチド、lyso とN –アセチル フォーム^{6,7 と呼ばれる 3 つの新規 N ターミナル リポタンパク質構造 ,8}。これらの調査結果はまだ発見の可能なリポ蛋白フォーム、様々 な形態を伝えるこれらの小説のリポタンパク質の作り方について基本的な質問どのような生理学的な目的や利点と一緒にについて問題を提起します。さらに、彼らは明らかに、リポ蛋白質の構造を予測するためのゲノム科学の現在できないことを示しています。確かに、リポタンパク質 N アシル基転移酵素は、腸球菌セレウス菌、lyso フォーム リポタンパク質⁹から点灯と呼ばれるの新しいクラスが最近わかりました。これは実験的、非常に疎水性とその分子構造の特性評価に利用可能な限られた方法のために挑戦することができますリポ蛋白の構造を確認する必要を示します。

リポ蛋白質 N 末端構造決定と同様に、宿主の免疫応答の誘導に関する研究を容易にするには、我々 は細菌性リポ蛋白質を浄化し、トリプシンの N 末端を準備するためにいくつか説明したプロトコルを適応しています。MALDI-TOF MS^6,10、11,12による解析のための lipopeptides。リポタンパク質は、汚染の非リポタンパク質を削除し、リポタンパク質の収穫を増加するための最適化を使用してメソッドを分割設立 (界面活性剤またはテキサス州 114 と今後は呼ばれる) Triton X-114 位相を用いた濃縮されています。これらの脂蛋白質は SDS ページによって更に精製、TLR の試金で直接使用するために適しています。MALDI-TOF MS の硝酸セルロースの膜にリポ蛋白の転送はトリプシン消化効率の良いその場の足場を提供し、洗浄、および高の結果、膜表面からその後溶出精製 N 末端 lipopeptides。ニトロセルロースは検体の取扱いを容易にし、リポタンパク質^{9,10 と同様に不可欠な膜蛋白質13,14から高疎水性ペプチド シーケンス カバレッジを向上させる示されています。}.このメソッドは単一の実験の N 末端構造決定と同時に精度の高いタンパク質同定の中間洗浄ソリューションを解析するので、極性に基づくペプチドを分留の付加的な利点.このプロトコル一意に機能意図的なナトリウムは、MS/MS Nアシル化状態の構造の割り当てを支援中に dehydroalanyl イオンに向かって親イオン化を促進するために形成を付加物します。N 末端は、リポタンパク質の TLR の認識に関連する最も変数とキーの両方の機能です。一緒に取られて、このプロトコルが精製と簡単に実験の全体的な目標に応じて適応 MALDI-TOF 質量分析法による構造決定の個々 の段階でのリポタンパク質に集中的に、再現性のある研究をできました。