העשרה של Lipoproteins חיידקי והכנה של N-מסוף Lipopeptides לקביעת מבנה באמצעות ספקטרומטר מסה
Summary
העשרת של חיידקי lipoproteins באמצעות שלב ללא יונית חומרים פעילי שטח למחיצות בשיטת מתואר שימוש ישיר במבחני TLR או יישומים אחרים. צעדים נוספים מפורטים להתכונן lipopeptides tryptic N-מסוף אפיון מבניים באמצעות ספקטרומטר מסה.
Abstract
Lipoproteins הם המרכיבים החשובים של המעטפה תא החיידק חזק מפעילי בתרבית של מערכת החיסון המולדת. למרות חשיבות שלהם תא פיזיולוגיה ואימונולוגיה, הרבה נשאר to be גילה על הרומן ליפופרוטאין טפסים, איך הם מסונתז וכן השפעת צורות שונות על חסינות המארח. כדי לאפשר מחקרים יסודיים lipoproteins, פרוטוקול זה מתאר שיטה של ליפופרוטאין חיידקי העשרה, הכנה של lipopeptides tryptic N-מסוף קביעת מבניים על ידי לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה ספקטרומטר מסה (MALDI-TOF MS). הרחבה על שלב טריטון X-114 הוקמה למחיצות בשיטת החילוץ ליפופרוטאין והעשרה של קרום התא חיידקי, הפרוטוקול כוללת צעדים נוספים כדי להסיר ליפופרוטאין שאינם מזהמים, ליפופרוטאין התשואה הגדלת ו טוהר. מאז lipoproteins משמשים בדרך כלל במבחני קולטן דמוי-אגרה (TLR), זה קריטי קודם לאפיין את מבנה N-מסוף על ידי גב’ MALDI-TOF שעל זה, שיטה מוצג לבודד פפטידים הידרופובי מרוכז מועשר ב- N-מסוף lipopeptides מתאימים לניתוח ישיר מאת Lipoproteins MS/גב’ MALDI-TOF המופרדים על ידי נתרן Dodecyl סולפט פולי-אקרילאמיד בג’ל (מרחביות-עמוד) מועברים קרום ניטרוצלולוזה, מתעכל בחיי עיר עם טריפסין, שטף ברצף כדי להסיר פפטידים tryptic הקוטב, סוף סוף eluted עם הכלורופורם-מתנול. כאשר משולב עם MS של פפטידים trypsinized קוטבי יותר מפתרונות לשטוף, שיטה זו מספקת את היכולת לזהות את ליפופרוטאין והן לאפיין את קצה אמיני בניסוי יחיד. נתרן מכוונת adduct היווצרות יכול גם להיות מועסק ככלי לקידום ספקטרה פיצול מבנית מקיף יותר. בסופו של דבר, העשרה של lipoproteins והנחישות של מבנים N-מסוף שלהם יאפשר מחקרים מקיפים יותר על מחלקה זו בכל מקום של חלבונים חיידקיים.
Introduction
חיידקי lipoproteins מאופיינים שנשמרת N-מסוף השומנים-השתנה ציסטאין זה מעגן את התחום חלבון הכדוריים השטח קרום התא. הם אוניברסלית מופצים בחיידקים, המהווים 2-5% של כל הגנים סלולר בתוך הגנום טיפוסי1. Lipoproteins לשחק תפקידים חיוניים במגוון רחב של תהליכים תאיים, לרבות ספיגת התזונתי, אותות, הרכבה של מתחמי חלבון, ושמירה על התא מעטפת המבנית2. של חיידקים פתוגניים, lipoproteins לשמש התקפה אלימה-גורמים-3,–4. במהלך זיהום, הכרה של N-מסוף lipopeptides על ידי קולטן דמוי-אגרה (TLR) 2 מסית תגובה חיסונית מולדת להסרת פתוגנים פולשים. בהתאם למצב acylation N-מסוף, lipoproteins מזוהים בדרך כלל על ידי קומפלקסים heterodimeric TLR2 חלופי. TLR2-TLR1 מזהה lipopeptides N-acylated, בעוד TLR2-TLR6 איגודים ליפופפטיד חינם α-אמינו טרמיני (termini). פעם מאוגדים, המסלולים איתות להתכנס לזירוז הפרשת proinflammatory-ציטוקינים-3,–4.
בעבר חשבו כי lipoproteins של חיידקים גראם חיוביים היו diacylated, ואלה מתוך חיידקים גראם שליליים היו triacylated, שונות היעדרות או נוכחות של חומצת שומן מקושרים אמיד על השאריות ציסטאין שנשמרת N-מסוף. הנחה זו נתמכה על ידי חוסר רצף orthologs בתוך הגנום גראם חיוביים כדי Lnt, טרנספראז גראם שליליים N-acyl השומן צורות lipoproteins triacylated5. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה חשפו ליפופרוטאין triacylation ב Firmicutes גראם חיוביים זה חוסר lnt, וכן שלושה מבנים ליפופרוטאין N-מסוף הרומן, כינה את peptidyl, lyso ו- N –acetyl טפסים6,7 ,8. ממצאים אלה מעלים שאלות על טפסים אפשרי ובכל זאת-כדי–שיגלו ליפופרוטאין, לצד שאלות עקרוניות על איך נוצרים אלה lipoproteins הרומן, איזו מטרה פיזיולוגיים או יתרון צורות שונות להקנות. יתר על כן, הם מדגימים בבירור היכולת הנוכחית של גנומיקה לחזות המבנה ליפופרוטאין. ואכן, לאחרונה זוהו מחלקה הרומן של ליפופרוטאין N-acyl השומן transferases, שנקרא Lit, Enterococcus faecalis , Bacillus קובו שגורם lipoproteins lyso-טופס9. אפשרות זו מציינת את הצורך לאמת השפעול ליפופרוטאין מבנה, אשר יכול להיות מאתגר עקב ואופיים הידרופובי מאד מוגבלת שיטות הזמינות לאפיין את המבנה המולקולרי שלהם.
כדי להקל על מחקרים על ליפופרוטאין אינדוקציה של התגובה החיסונית מארח את, כמו גם נחישות מבניים N-מסוף, אנחנו הסתגלו מספר פרוטוקולים שתואר קודם לכן על מנת לטהר lipoproteins חיידקי ולהכין את N-מסוף tryptic lipopeptides לניתוח-MALDI-TOF MS6,10,11,12. Lipoproteins מועשרים באמצעות שלב X-114 טריטון (המכונה מעתה ואילך חומרים פעילי שטח או TX-114) הוקמה למחיצות בשיטת, עם אופטימיזציה להסיר ההרסנית הלא-lipoproteins ולהגדיל את התשואה ליפופרוטאין. Lipoproteins אלו מתאימים לשימוש ישיר במבחני TLR או לטיהור עוד יותר על ידי עמודים מרחביות. עבור MALDI-TOF MS, העברה של ליפופרוטאינים ניטרוצלולוזה ממברנה מספק לפיגום לעיכול יעיל בחיי עיר טריפסין, שטיפה, עוקבות • תנאי מהמשטח ממברנה, וכתוצאה מכך מאוד מטוהר lipopeptides N-מסוף. ניטרוצלולוזה הוכח כדי להקל על הטיפול מדגם ולשפר את רצף כיסוי מתאים מאוד הידרופובי פפטידים ממברנלי אינטגרלי חלבונים13,14, וכן lipoproteins9,10 . השיטה יש יתרון נוסף של fractionating פפטידים בהתבסס על קוטביות, כך ניתן לנתח פתרונות ביניים שטיפת לזיהוי החלבון בוודאות גבוהה בד בבד עם N-מסוף קביעת מבניים בניסוי יחיד . פרוטוקול זה ייחודי נתרן מכוונת תכונות adduct צורה כדי לקדם את האב יון פיצול לכיוון dehydroalanyl יונים במהלך MS/MS, בסיוע במשימה מבנית של המדינה – acylation N. קצה אמיני הוא שני ביותר משתנה מפתח התכונה הקשורים לזיהוי TLR של lipoproteins. יחדיו, פרוטוקול זה אפשרה מחקרים אינטנסיביים לשחזור על lipoproteins, עם השלבים בודדים של טיהור ונחישות מבניים על-ידי MS MALDI-TOF להתאים בקלות בהתאם המטרה הכוללת של הניסוי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול במסמך זה מתאר שני שלבים של ליפופרוטאין אפיון: העשרה על ידי TX-114 שלב קביעת חלוקה למחיצות ומבניים על-ידי MS MALDI-TOF. במהלך החילוץ TX-114, צנטריפוגה נוספים הסרת מזהמים חלבונים לזרז במהלך תהליך זה, ואחריו אצטון משקעים להניב lipoproteins מועשר. על ידי הגבלת היקף כל הכנה 15-mL שווה של תאים, מספר דגימות י…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר במעבדה מרדית נתמכה על ידי קרנות האתחול המסופקים על ידי המכללה אברלי של המדע (אוניברסיטת המדינה של פנסילבניה). אנו מודים ד ר טטיאנה Laremore על גישה לציוד פן סטייט פרוטאומיקס, מסה ספקטרומטר הליבה מתקן, אוניברסיטת פארק, פנסילבניה, בו בוצעו ניתוחים spectrometric המוני וייעוץ טכני מומחה.
Materials
| Materials | |||
| 0.01 mm Zirconia/silica beads | BioSpec Products | 110791012 | |
| Acetic acid | EMD | AX0073-9 | |
| Acetone | EMD | AX0116-6 | |
| Acetonitrile | EMD | AX0142-6 | |
| Ammonium bicarbonate | Fluka Analytical | 09830 | |
| BioTrace NT Nitrocellulose | PALL Life Sciences | 66485 | |
| Bovine serum albumin (BSA) digest standard | Protea | PS-204-1 | |
| Chloroform | Acros Organics | 423550025 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP118 | |
| HPLC Grade water | EMD | WX0008-1 | |
| Lysozyme | Fisher Scientific | BP535-1 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| Phenylmethyl sulfonyl fluoride (PMSF) | Amresco | 0754 | |
| Pierce trypsin protease | Thermo Scientific | 90057 | |
| Ponceau S | Acros Organics | 161470100 | |
| Protein LoBind Tube 0.5mL | Eppendorf | 022431064 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519 | |
| Sodium chloride | Macron Fine Chemicals | 7581-06 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | 299537 | |
| Tris-hydrochloride (HCl) | Fisher Scientific | BP152 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | 93422 | |
| Tryptic soy broth (TSB) | BD | 211822 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (MS Grade) | Sigma-Aldrich | C8982 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| MagNALyser | Roche | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| MALDI-TOF target | Bruker Daltonics | ||
| Ultraflextreme MALDI-TOF-TOF | Bruker Daltonics | Equipped with a 355 nm frequency-tripled Nd:YAG smartbeam-II laser |
Referencias
- Babu, M. M., et al. A database of bacterial lipoproteins (DOLOP) with functional assignments to predicted lipoproteins. J Bacteriol. 188 (8), 2761-2773 (2006).
- Narita, S., Tokuda, H. Bacterial lipoproteins; biogenesis, sorting and quality control. Biochim Biophys Acta. 1862 (11), 1414-1423 (2016).
- Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. Lipoproteins of bacterial pathogens. Infect Immun. 79 (2), 548-561 (2011).
- Nguyen, M. T., Götz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 891-903 (2016).
- Nakayama, H., Kurokawa, K., Lee, B. L. Lipoproteins in bacteria: structures and biosynthetic pathways. FEBS J. 279 (23), 4247-4268 (2012).
- Kurokawa, K., et al. Novel bacterial lipoprotein structures conserved in low-GC content Gram-positive bacteria are recognized by Toll-like receptor 2. J Biol Chem. 287 (16), 13170-13181 (2012).
- Kurokawa, K., et al. The Triacylated ATP Binding Cluster Transporter Substrate-binding Lipoprotein of Staphylococcus aureus Functions as a Native Ligand for Toll-like Receptor 2. J Biol Chem. 284 (13), 8406-8411 (2009).
- Asanuma, M., et al. Structural evidence of α-aminoacylated lipoproteins of Staphylococcus aureus. FEBS J. 278 (5), 716-728 (2011).
- Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Identification of the Lyso-Form N-Acyl Intramolecular Transferase in Low-GC Firmicutes. J Bacteriol. 199 (11), e00099-e00017 (2017).
- Serebryakova, M. V., Demina, I. A., Galyamina, M. A., Kondratov, I. G., Ladygina, V. G., Govorun, V. M. The acylation state of surface lipoproteins of Mollicute Acholeplasma laidlawii. J Biol Chem. 286 (26), 22769-22776 (2011).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Induced mouse spleen B-cell proliferation and secretion of immunoglobulin by lipid-associated membrane proteins of Mycoplasma fermentans incognitus and Mycoplasma penetrans. Infect Immun. 62 (9), 3916-3921 (1994).
- Feng, S. H., Lo, S. C. Lipid extract of Mycoplasma penetrans proteinase K-digested lipid-associated membrane proteins rapidly activates NF-kappaB and activator protein 1. Infect Immun. 67 (6), 2951-2956 (1999).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Spellman, D. S., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics. 7 (2), 308-314 (2008).
- Luque-Garcia, J. L., Zhou, G., Sun, T. -. T., Neubert, T. A. Use of Nitrocellulose Membranes for Protein Characterization by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry. Anal Chem. 78 (14), 5102-5108 (2006).
- Kurokawa, K., et al. Environment-mediated accumulation of diacyl lipoproteins over their triacyl counterparts in Staphylococcus aureus. J Bacteriol. 194 (13), 3299-3306 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schӓgger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protoc. 1, 16-22 (2006).
- Gravel, P. Protein Blotting by the Semidry Method. The Protein Protocols Handbook. , 321-334 (2002).
- Webster, J., Oxley, D. Protein Identification by Peptide Mass Fingerprinting using MALDI-TOF Mass Spectrometry. The Protein Protocols Handbook. , 1117-1129 (2009).
- Wilkins, M. R., et al. Detailed peptide characterization using PEPTIDEMASS – a World-Wide-Web-accessible tool. Electrophoresis. 18 (3-4), 403-408 (1997).
- Gasteiger, E., et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
- Perkins, D. N., Pappin, D. J. C., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
- Al-Saad, K. A., Zabrouskov, V., Siems, W. F., Knowles, N. R., Hannan, R. M., Hill, H. H. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of lipids: ionization and prompt fragmentation patterns. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (1), 87-96 (2003).
