הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

היא ידועה בעיקר כי ריפוי הפצע בבעלי חיים הוא תהליך מהותי לכונן מחדש את תקינות ואת תפקוד תקין של רקמות שכבות לאחר פציעה¹. למרות אפיתל משטחים חשופים לסביבה החיצונית (למשל, העור, מערכת הנשימה, ו נרחבים במערכת העיכול) ליצור מחסום מגן מפני עלבונות פיזיקליות, כימיות, היווצרות הפצעים יכול בקלות להתרחש, במיוחד אחרי ניתוח או זיהומים חיידקים². לדוגמה, קולוניזציה של רקמת הריאה על ידי פתוגן חיידקי הזדמנותית Pseudomonas aeruginosa, במיוחד אצל חולי סיסטיק פיברוזיס (CF), מוביל לפגיעה של האפיתל איירווייז עם כשל נשימתי הסוגר^{3, 4}. ריפוי הפצע הוא מנגנון תיקון מארח מורכבים כדי לשחזר את הארכיטקטורה נורמלי של רקמות הפצועים⁵. היא מאופיינת על ידי דלקת ראשונית, ואחריו נקודה ההתחדשות המקיף epithelialization, אנגיוגנזה, ושחזור רקמות עם ייצור קולגן תא בידול^6,7,8 . כדי להבטיח את תקינות אפיתל וכדי לשלוט התפשטות חיידקים, כל היצורים החיים לייצר מולקולות ההגנה, לרבות מיקרוביאלית פפטידים (אמפר)^9,10. תהליך ריפוי הפצע קשה מאוד לדמות במבחנה בשל היעדר שאריות תאים ואינטראקציות מורכבים בין סוגי תאים שונים. עם זאת, במבחנה היכולת של פפטיד כדי להאיץ את הסגר על פצע מדומה על ידי גירוי נדידה של תאים אפיתל היא מעידה על היכולת לרפא האפיתל הנגוע. אכן, נדידת תאים הוא אירוע הגבלת קצב בריפוי הפצע, לומד גורמים שיכולים להשפיע על נדידת תאים יעזור היעד טיפולים לריפוי הפצע משופרת.

כאן, assay ניסיוני מאוד לשחזור מסופק המבוססת על סיליקון מיוחד תרבות מוסיף להעריך תא העברה בתוך חוץ גופית. היא מבוססת על יצירת פער μm 500 (הפצע מדומה) על טפט התא confluent. התאים בקצה השדה “הפצוע” מלאכותי יתחיל נודדות לאזור ללא תאים, ויצרו קשרים תאים תאים חדשים. הוסף תרבות מייצג כלי חדש עבור ריפוי ניסויים הפצע מהר. שני מאגרים המופרדות על-ידי קיר μm 500 הינם מסופקים, ושיחות ניתן כהלכה להניח לתוך צלחת צלחת 3-ס”מ או בבאר של צלחת 12-. טוב. מילוי כל תא של הקדמי עם השעיה התא מאפשר לתאים לגדול בכל אזור המיועד עד למפגש, בזמן ההסרה של הקדמי לעורר רווח נקי ללא תא של 500 μm (באותו רוחב כמו חומת ההפרדה). מדיום התרבות התא הנכון עם תרכובת מבחן אז ניתן להוסיף לתוך המנה לצלחת/טוב. לאחר מכן, ניתן לאבחן על סגירת הפער במרווחי זמן שונים תחת מיקרוסקופ הפוכה, רצוי אחד מצויד מצלמת וידיאו עבור ייבוא תמונות. לבסוף, מדידה של שינויים באזור המכוסה תא על-ידי התוכנית ניתוח תמונות אוטומטית מבוססת אינטרנט יאפשר כימות של מהירות ההעברה הסגר ותא הפצע. בסך הכל, שיטה זו היא צעד אחד קדימה ביחס וזמינותו קלאסי, בו שריטה מתבצעת באופן ידני על-ידי אם תא confluent monolayers עם מחט סטרילית או פיפטה עצה¹¹. אכן, ההליך האחרון יכול להרוס בתחתית קערה פלסטיק צלחת/טוב, הציפוי על פני השטח, יצירת קמטים. בנוסף, האזור “הפצוע” לא קיימת רוחב מוגדרים היטב לכל אורכו של הפער, מכיוון שזה מאוד תלוי הלחץ שהופעל על ידי חוקרים המחט/טיפ. יתר על כן, התאים ונדרש שיכולים להיווצר גושים של תאים חי וגם מת בקצוות של השריטה; יתר על כן, הפצת התאים החיים לאזור “הפצוע” יכול להתערב עם המהירות של נדידת תאים, הפקת תוצאות שאינן לשחזור¹².

בנוסף, הודות פלטפורמה ניתוח תמונת הטיוטה, משתמשים יכולים במהירות לקבל (בתוך דקות) נתונים כמותיים על ההתנהגות הנדידה של התאים שנבחרו ללא הצורך ברכישת תוכנות נוספות. פלטפורמה זו הוא מסוגל לנתח שלב תמונות מיקרוסקופ בניגודיות נמוכה (~ 5 X), בינוני (~ 10 X), הגדלה גבוהה (~ 20 X). לאחר העלאת קובץ zip של תמונות (ב- *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff תבנית) הניתוח מבוצע באופן אוטומטי כדי ליצור קובץ סיכום המציגה את אחוז מכוסי תא אזורים ואזורי מאפס, כמו גם המהירות של התא הגירה, במרווחי זמן שונים.

בעבודה זו, באמצעות כח-נגזרת צפרדע-עור, קרי Esc(1-21), שלה diastereomer Esc(1-21) – 1c¹³, קו תא הסמפונות לבטא את תפקודי CF מוליכות transmembrane הרגולטור (CFTR)^14,15, דוגמה של נדידת תאים פפטיד-induced לעומת דגימות ללא טיפול (בקרה) מסופק. שימו לב כי אפיתל דרכי הנשימה ואת CFTR לשחק תפקיד מכריע בשמירה על תפקוד הריאות, פצע תיקון¹⁶. יתר על כן, על-ידי מעכבי סלקטיבית (למשל, AG1478)¹⁷ של קולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), כרוך ראיות כי ההעברה של תאים הסמפונות המושרה על ידי פפטידים הנ ל ההפעלה של EGFR^{12, 18} הוא דיווח.

לסיכום, המטרה של נוהל זה היא להראות כיצד השימוש כזה מוסיף תרבות סיליקון מייצג של assay מהיר ונגיש בקלות כדי לקבוע במדויק נדידה של תאים חסיד (למשל, ברונכיט תאים אפיתל) ומולקולרית מנגנוני שליטה אירועים כאלה.