Een roman In Vitro wond genezing Assay om te evalueren van de cel migratie

Het is grotendeels bekend dat wondgenezing in dieren een fundamentele proces is om opnieuw de integriteit en de normale functie van lagen weefsel na letsel¹. Ondanks de epitheliale oppervlakken die zijn blootgesteld aan de externe omgeving (bijvoorbeeld de huid, luchtwegen, en gastro-intestinale traktaten) vormen een beschermende barrière van fysische en chemische beledigingen, de vorming van wonden kan gemakkelijk optreden, vooral na chirurgie of microbiële infecties². Als voorbeeld leidt kolonisatie van longweefsel door de opportunistische bacteriële pathogenen Pseudomonas aeruginosa, met name in cystic fibrosis (CF) patiënten, tot schade aan het epitheel van de luchtwegen met daaruit voortvloeiende respiratoir falen^{3, 4}. Wondgenezing is een complexe host reparatie mechanisme om te herstellen van de normale architectuur van een gewonde weefsel⁵. Het wordt gekenmerkt door een eerste ontsteking, gevolgd door een periode van de regeneratie omvat epithelialization, angiogenese, en weefsel remodeling met collageenproductie en cel differentiatie^6,7,8 . Om de integriteit van de epitheliale garanderen en zo de besturing van de microbiële proliferatie, produceren alle levende organismen verdediging moleculen, met inbegrip van antimicrobiële peptiden (AMPs)^9,10. De wond genezing proces is zeer moeilijk te simuleren in vitro als gevolg van het ontbreken van cel puin en complexe interacties tussen de verschillende soorten cellen. Echter de mogelijkheid in vitro van een peptide voor het versnellen van de sluiting van een pseudo-wond door het stimuleren van migratie van epitheliale cellen is kenmerkend voor haar vermogen om te genezen van een gecompromitteerde epitheel. Inderdaad, cel migratie is een snelheidsbeperking evenement in de wondgenezing en bestuderen van de factoren die van invloed kunnen zijn op de cel migratie zal bijdragen tot doel therapieën voor betere wondgenezing.

Hier, wordt een zeer reproduceerbaar experimentele bepaling verstrekt op basis van speciale silicone cultuur inzetstukken te evalueren cel migratie in vitro. Het is gebaseerd op het creëren van een 500 μm kloof (pseudo-wond) op een enkelgelaagde confluente cel. De cellen aan de rand van de kunstmatige “wounded” veld zal beginnen migreren in de cel-vrije zone, de vorming van de nieuwe cel contacten. Het invoegen van cultuur vertegenwoordigt een nieuw instrument voor snelle wond genezing experimenten. Twee reservoirs die zijn gescheiden door een muur μm 500 worden geleverd, en ze kunnen goed geplaatst worden in een plaat van 3 cm schotel of in de put van een 12-well-plate. Elk compartiment van de insert te vullen met een celsuspensie kunt cellen groeien in elke aangewezen zone tot samenvloeiing, terwijl verwijdering van het donormateriaal zal het nastreven van een schoon cel-vrije kloof van ongeveer 500 μm (dezelfde breedte als de scheidingsmuur). De juiste cel voedingsbodem aangevuld met een teststof kunnen vervolgens worden toegevoegd in de schotel plaat per putje. Daarna kan de kloof sluiting op verschillende tijdstippen onder een omgekeerde Microscoop, bij voorkeur een uitgerust met een video-camera voor Beeldacquisitie worden gevisualiseerd. Tot slot zal de meting van veranderingen in de cel bedekte gebied door de web gebaseerde image met geautomatiseerde analyseprogramma de kwantificering van de snelheid van de wond sluiting en cel migratie toestaan. Deze methode is over het geheel genomen een stap voorwaarts met betrekking tot de klassieke bepaling, waar een kras is handmatig gemaakt door confluente cel monolayers gebeuren met een steriele naald of een pipet tip¹¹. Inderdaad, de laatste procedure op de plastic onderkant van de schotel kan vernietigen plaat per putje en de oppervlaktelaag, rimpels maken. Bovendien, het “wounded” gebied beschikt niet over een welomschreven breedte langs de gehele lengte van de kloof, zoals dit is sterk afhankelijk van de uitgeoefende door onderzoekers naar de naald/tip. Bovendien, de dislodged cellen kunnen vormen bosjes van levende en dode cellen aan de randen van de kras; Bovendien, de verspreiding van levende cellen in het “wounded” gebied kan interfereren met de snelheid van cel migratie, het genereren van niet-reproduceerbare resultaten¹².

Bovendien, dankzij een kras beeld analyse platform, kunnen gebruikers snel ontvangen (in minuten) kwantitatieve gegevens over het trekgedrag van de geselecteerde cellen zonder de noodzaak van het verwerven van extra software. Dit platform is geschikt voor het analyseren van de fase contrast microscopie afbeeldingen van lage (~ 5 X), medium (~ 10 X) en hoog (~ 20 X) vergroting. Na het uploaden van een zip-bestand van beelden (in *.jpg *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff formaat) wordt de analyse automatisch uitgevoerd om een samenvatting bestand genereren dat het percentage van zowel cel bedekte gebieden en kras gebieden, alsmede de snelheid van de cel toont migratie, op verschillende tijdstippen.

In dit werk, met behulp van een kikker-huid AMP-derivaat, dat wil zeggen Esc(1-21) en haar Diastereomeer Esc(1-21) – 1 c¹³en een bronchiale cellijn uitdrukken van de functionele CF transmembraan huidgeleiding regulator (CFTR)^14,15, een voorbeeld van peptide-geïnduceerde cel migratie in vergelijking met onbehandelde (controlemonsters) wordt verstrekt. Merk op dat het epitheel van de luchtwegen en CFTR een cruciale rol spelen bij het handhaven van de longfunctie en wond reparatie¹⁶. Bovendien, door middel van selectieve inhibitors (bijvoorbeeld AG1478),¹⁷ van de epidermale groeifactor receptor (EGFR), bewijs dat migratie van bronchiale cellen geïnduceerd door de bovengenoemde peptiden activering van EGFR^{12impliceert, 18} wordt gemeld.

Kortom is het doel van deze procedure om te laten zien hoe het gebruik van dergelijke siliconen cultuur inzetstukken vertegenwoordigt een snelle en gemakkelijk toegankelijke assay nauwkeurig bepalen migratie van Adherente cellen (bijvoorbeeld bronchiale epitheliale cellen) en de moleculaire mechanismen waarmee dergelijke gebeurtenissen worden bestuurd.