Procedimientos de fabricación y medidas de birrefringencia para diseñar Ion lantánido magnéticamente sensibles quelantes ensamblajes de fosfolípidos

Bicelles son conjuntos polimoleculares de disco como de numerosas mezclas de lípidos. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} son ampliamente utilizados para la caracterización estructural de biomoléculas de membrana por espectroscopia de RMN. ^{6 , 7} sin embargo, los esfuerzos recientes tienen por objeto ampliar el campo de posibles aplicaciones. ^{5 , 8 , 9} el sistema de bicelle más estudiado se compone de una mezcla de 1, 2-dimyristoyl –sn– glycero-3-fosfocolina (DMPC), constituyendo la parte plana de la Asamblea y 1, 2-dihexanoyl –sn– glycero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolípido que cubre el borde. ^{1 , 2 , 3} la geometría molecular de las composición de la bicapa de fosfolípidos determinan la arquitectura de la estructura de uno mismo-montado polimoleculares. ^{4 , 5} reemplazo de DHPC con DTPA DMPE genera sistemas de bicelle altamente magnético sensible y armonioso. ^{10 , 11} DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) bicelles asociado con muchos más iones lantánidos paramagnéticos (Ln^{3 +}) en la superficie de la bicapa, resultando en una mayor respuesta magnética. ¹⁰ por otra parte, reemplazando las moléculas solubles en agua de DHPC con^{3 +} permite DMPE-DTPA/Ln la formación de bicelles resistente a la dilución. ¹¹

Su energía magnética en general, obedece a la alignability magnética de conjuntos polimoleculares planar

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donde B es la fuerza del campo magnético, el magnético n constante, el número de agregación y la anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular de las composición de la bicapa de lípidos. Por lo tanto, la respuesta de DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles a los campos magnéticos se adapta por su tamaño (número n total) y el Δχ de anisotropía de susceptibilidad diamagnético molecular. Este último se obtiene fácilmente cambiando la naturaleza de los quelatos Ln^{3 +}. ^{12 , 13 , 14 , 15} introducción colesterol (Chol-OH) u otros derivados esteroides en la bicapa ofrece la posibilidad de templar el agregado número n y la Δχ de la susceptibilidad magnética de las Asambleas. ^{11 , 16 , 17 , 18 , 19} para una composición de lípidos determinado, asambleas más grandes contienen más lípidos capaces de contribuir a la E_mag (n número total más grande), dando lugar a especies más alignable. Por ejemplo, el tamaño de bicelles DMPC/DHPC, convencionalmente se controla a través de la optimización de la concentración de lípidos en relación o total composición. ^{20 , 21 , 22} aunque esto es posible en DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, su transformación termo-reversible de bicelle vesículas sobre la calefacción ofrece había añadido opciones de adaptación. Mecánica: por ejemplo la extrusión a través de filtros de membrana permite la formación de las vesículas. Las bicelles magnética alignable se regeneran en refrigeración a 5 ° C y sus dimensiones son dictadas a partir de los precursores de la vesícula. ¹¹ adjunto, nos centramos en el potencial de los procedimientos de fabricación mecánica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) como sistemas de referencia. El proceso funciona de manera análoga cuando se trabaja con otros Ln^{3 +} que Tm^{3 +}. La amplia gama de posibilidades que ofrecen estas técnicas se destaca en la figura 1 y ampliamente discutido en otros lugares. ²³

Figura 1: Descripción esquemática de los procedimientos de fabricación posible. Las estudiadas magnéticamente alignable Ln^{3 +} quelantes polimoleculares asambleas están compuestas de cualquier DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (proporción molar de 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5). La película lipídica seca se hidrata con un 50 mM de tampón fosfato a un pH de 7.4 y la concentración total de lípidos es 15 mM. Una hidratación eficaz de la película de lípidos requiere ya sea congelación descongelación ciclos (FT), o calefacción y ciclos de refrigeración (H & C). H & C ciclos son necesarios para la regeneración de las muestras después de la última helada descongelación paso o regenerar muestras mantuvo congeladas durante un período prolongado de tiempo si han de usarse sin más la protuberancia. Estos pasos se discuten extensivamente por Isabettini et al. Se consiguen ²³ polimoleculares máximo alignable asambleas, ofrecer arquitecturas ensamblado diferente basadas en la composición de lípido. El tamaño de la bicelle y la alignability magnética es sintonizable por extrusión (Ext) a través de filtros de membrana nanopore. La alineación presentada factores A_f se computaron a partir de patrones de dispersión (SANS) 2D ángulo pequeño neutrón de una DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (fracción molar 16:4:5:5) muestra que se saca a través de 800, 400, 200 o 100 nm poros. SANS las mediciones son un medio complementario de cuantificación de la alineación de bicelle que no se tratarán más detalladamente en este documento. ^{11 , 16} el_f oscila entre -1 (dispersión de neutrones paralelo o alineación perpendicular de la bicelles con respecto a la dirección del campo magnético) a 0 para dispersión isotrópica.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La estructura del bicelles ha sido extensamente estudiada por una amplia gama de técnicas de caracterización. ¹³ la alineación de bicelles expuestas a un campo magnético se ha cuantificado mediante espectroscopia RMN o ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) de experimentos. ^{5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25} sin embargo, el cambio y ensanchamiento de los picos de NMR que ocurre en presencia de Ln^{3 +} son serias limitaciones al método. ^{15 , 26 , 27 , 28} aunque SANS experimentos no sufren de esta limitación, alternativa y técnicas más accesibles son deseables para la cuantificación rutinaria de alineación magnéticamente inducida de asambleas en la solución. Medidas de birrefringencia son una alternativa viable y relativamente simple. Análogamente a los experimentos de NMR, mediciones de birrefringencia revelan información valiosa sobre los cambios de lípidos y lípidos fases que ocurren en la bicapa. Por otra parte, transformaciones geométricas que se producen en el conjunto polimoleculares con cambio de condiciones ambientales como la temperatura se controlan. ^{11 , 12 , 13 , 16} Δn′ de birrefringencia inducida magnéticamente se ha utilizado para estudiar varios tipos de sistemas de fosfolípido. ^{13 , 29 , 30} medidas de birrefringencia basadas en la técnica de modulación de fase en un campo magnético es un método viable para detectar orientación de bicelles. ^{12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32} la posibilidad de investigar bicelles con birrefringencia en altos campos magnéticos de hasta 35 T también fue demostrada por M. Liebi et al. ¹³

Cuando la luz polarizada entre un material anisotrópico, se refracta en una onda ordinaria y extraordinaria. ¹¹ las dos ondas tienen diferentes velocidades y se cambia de puesto en fase por una δ de retraso. El grado de retardo δ es medido y convertido en una señal de birrefringencia para cuantificar el grado de anisotropía en el material

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donde λ es la longitud de onda del láser y d es el espesor de la muestra. Los fosfolípidos son ópticamente anisotropic y su eje óptico coincide con sus ejes moleculares largo, paralelos a la cola de hidrocarburo. ^{11 , 12} ningún retraso se mide si los fosfolípidos están orientados aleatoriamente en solución. Retraso se mide cuando los fosfolípidos están alineados paralelos uno al otro. La birrefringencia inducida magnéticamente puede tener un signo positivo o negativo dependiendo de la orientación de las moléculas en el campo magnético; Vea la figura 2. Los fosfolípidos alineados paralelos al eje x dará como resultado un negativo , mientras que ésos alineados a lo largo del eje z como resultado positivo . Birrefringencia no se observa cuando el eje óptico coincide con la dirección de propagación de la luz como el fosfolípido alinea paralelo al eje y.

Figura 2: Alineación de los fosfolípidos y el signo correspondiente de la birrefringencia inducida magnéticamente . El signo de la medida depende de la orientación de los fosfolípidos en el campo magnético. Las líneas punteadas indican el eje óptico de la molécula. La luz está polarizada a 45° y se propaga en la dirección y. El campo magnético B es en la dirección z. Esta figura ha sido modificada de M. Liebi. ¹¹ haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

En el caso de una suspensión coloidal isotrópica de bicelles, la orientación inducida por el arreglo de los fosfolípidos en la bicapa se perderá, poner a cero el δ de retraso. La bicelles también debe quedar alineada con el fin de orientar los fosfolípidos ópticamente activos en sus bicapas, causando una retraso δ de la luz polarizada. En consecuencia, la birrefringencia es una herramienta sensible para cuantificar la alignability magnética de conjuntos polimoleculares. Bicelles alineado perpendicularmente al campo magnético producirá un positivo , mientras que ésos alineados paralelos dará una negativa . El signo depende de la alineación de la instalación y se puede verificar con una muestra de referencia.