Procedimentos de fabricação e medições de birrefringência por projetar Lanthanide magneticamente responsivo Ion quelantes Phospholipid assembleias

Bicelles são polymolecular de disco-como conjuntos obtidos de várias misturas de lipídios. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} são amplamente utilizados para a caracterização estrutural de membrana biomoléculas por espectroscopia RMN. ^{6 , 7} no entanto, os recentes esforços visam expandir o campo de aplicações possíveis. ^{5 , 8 , 9} o sistema bicelle mais estudado é composto por uma mistura de 1,2-dimyristoyl –sn– glicero-3-fosfocolina (ácido), que constituem a parte plana da Assembleia e 1,2-dihexanoyl –sn– glicero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolipídeo cobrindo a borda. ^{1 , 2 , 3} a geometria molecular do compondo a BICAMADA de fosfolipídios ditar a arquitetura da estrutura de polymolecular Self montado. ^{4 , 5} substituir DHPC com DMPE-DTPA gera sistemas bicelle magneticamente altamente responsivo e ajustáveis. ^{10 , 11} ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (razão molar 4:1:1) bicelles associar com muitos mais íons lantanídeos paramagnético (Ln^{3 +}) na superfície da bicamada, resultando em uma resposta magnética melhorada. ¹⁰ além disso, substituindo as moléculas hidrossolúveis de DHPC DMPE-DTPA/Ln^{3 +} permite que a formação de bicelles resistente a diluição. ¹¹

A alignability magnética das assembleias polymolecular planar é ditada pela sua energia magnética total,

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onde B é a intensidade do campo magnético, o magnético constante, n o número de agregação e a anisotropia de susceptibilidade diamagnético molecular dos lipídeos compondo a BICAMADA. Portanto, a resposta do ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles a campos magnéticos é costurada por seu tamanho (n número agregado) e o Δχ de anisotropia de susceptibilidade diamagnético molecular. Este último é prontamente alcançado alterando a natureza do Ln quelatadas^{3 +}. ^{12 , 13 , 14 , 15} apresentando colesterol (Chol-OH) ou outros derivados de esteroides na BICAMADA oferece a possibilidade de ajuste tanto o agregado número n e o Δχ de susceptibilidade magnética dos assemblies. ^{11 , 16 , 17 , 18 , 19} para uma composição de lipídios determinado, maiores assemblies contêm lipídios mais capazes de contribuir para o E_mag (maior agregação número n), resultando em mais ajustável em espécie. O tamanho do ácido/DHPC bicelles, por exemplo, convencionalmente é controlado através da otimização da composição lipídica ratio ou total concentração. ^{20 , 21 , 22} embora isso seja possível em ácido/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, sua transformação de thermo-reversível de bicelle para vesículas sobre ofertas de aquecimento adicionou opções de alfaiataria. Meios mecânicos, tais como extrusão através de filtros de membrana permite a formação das vesículas. Os magneticamente ajustável em bicelles são regenerados em cima de refrigerar a 5 ° C e suas dimensões são ditadas de precursores da vesícula. ¹¹ aquiem, focalizamos o potencial dos processos de fabricação mecânica com ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) ou ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) como sistemas de referência. O processo funciona de forma análoga ao trabalhar com outros Ln^{3 +} do que Tm^{3 +}. A vasta gama de possibilidades oferecidas por estas técnicas são destacadas na Figura 1 e amplamente discutido em outro lugar. ²³

Figura 1: visão geral esquemática dos procedimentos de fabricação possível. Os estudados magneticamente ajustável em Ln^{3 +} quelante polymolecular assemblies são compostas de qualquer ácido/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 4:1:1) ou ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5). O filme lipídico seco é hidratado com um tampão de fosfato de 50 milímetros em um valor de pH de 7,4 e a concentração de lipídios total é de 15 mM. Uma eficaz hidratação do filme lipídico requer também congelar descongelar ciclos (FT) ou aquecimento e arrefecimento ciclos (H & C). H & C ciclos são necessários para regenerar as amostras após a última congelar descongelar passo ou para regenerar as amostras mantidas congeladas durante um período prolongado de tempo, se eles devem ser usados sem mais extrusão. Estas etapas são discutidas extensivamente por Isabettini et al. ²³ polymolecular màxima ajustável em módulos (assemblies) é alcançados, entregando arquiteturas assembly diferente com base na composição lipídica. O tamanho de bicelle e alignability magnética é sintonizável por extrusão (Ext) através de filtros de membrana nanopore. O alinhamento apresentado fatores A_f foram calculados a partir de padrões de dispersão (SANS) de nêutrons 2D ângulos pequenos de uma amostra de ácido/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (razão molar 16:4:5:5) extrudados através de 800, 400, 200 ou 100 nm poros. SANS medições são meios complementares de quantificar bicelle alinhamento que não será abordado em mais detalhes aqui. ^{11 , 16} o A_f varia de -1 (dispersão de nêutrons paralelo ou alinhamento perpendicular da bicelles em relação a direção do campo magnético) como 0 para dispersão isotrópica.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A estrutura do bicelles tem sido estudada extensivamente por uma vasta gama de técnicas de caracterização. ¹³ o alinhamento de bicelles expostos a um campo magnético foi quantificado usando espectroscopia RMN ou experimentos de espalhamento (SANS) ângulo pequeno neutrão. ^{5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25} no entanto, o turno e o alargamento dos picos NMR ocorrem na presença de Ln^{3 +} são sérias limitações para o método. ^{15 , 26 , 27 , 28} SANS embora experimentos não sofrem essa limitação, alternativa e técnicas mais acessíveis são desejáveis para quantificação de rotina de alinhamento magneticamente induzida de módulos (assemblies) em solução. Medições de birrefringência são uma alternativa viável e comparativamente simples. De forma análoga às experiências NMR, medições de birrefringência revelam informações valiosas sobre rearranjos de lipídios e fases de lipídios, ocorrendo na BICAMADA. Além disso, transformações geométricas, ocorrendo no assembly polymolecular com a mudança de condições ambientais, tais como a temperatura são monitoradas. ^{11 , 12 , 13 , 16} Δn′ birrefringência magneticamente induzida serviu para estudar vários tipos de sistemas de fosfolípidos. ^{13 , 29 , 30} medições de birrefringência, baseadas na técnica de modulação de fase em um campo magnético é um método viável para detectar a orientação de bicelles. ^{12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32} a possibilidade de investigar bicelles com birrefringência em altas campos magnéticos até 35 T também foi demonstrada por M. Liebi et al ¹³

Quando a luz polarizada entre um material anisotrópico, irá ser refratado em uma onda ordinária e extraordinária. ¹¹ as duas ondas têm velocidades diferentes e são transferidas em fase por um δ de retardo. O grau de retardo δ é medido e convertido em um sinal de birrefringência para quantificar o grau de anisotropia no utilizando material

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onde λ é o comprimento de onda do laser e d é a espessura da amostra. Fosfolipídios são opticamente anisotrópicos e seu eixo óptico coincide com seus eixos tempo moleculares, paralelamente as caudas de hidrocarbonetos. ^{11 , 12} sem atraso é medido se os fosfolípidos são orientados aleatoriamente na solução. Retardamento é medido quando fosfolípidos estão alinhados paralelamente uns aos outros. A birrefringência magneticamente induzida pode ter um sinal positivo ou negativo, dependendo da orientação das moléculas no campo magnético; consulte a Figura 2. Fosfolipídios alinhados paralelamente ao eixo x resultará em um negativo , enquanto que aqueles alinhados ao longo do eixo z positivo . Não birrefringência é observada quando o eixo ótico coincide com a direção de propagação de luz como o fosfolípido alinha paralelamente ao eixo y.

Figura 2: Alinhamento dos fosfolipídios e sinal correspondente a birrefringência magneticamente induzida . O sinal de que a medida varia de acordo com a orientação do phospholipid em campo magnético. Linhas tracejadas indicam o eixo óptico da molécula. A luz é polarizada a 45° e se propaga na direção y. O campo magnético B é na direção z. Esta figura foi modificada de M. Liebi. ¹¹ por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

No caso de uma suspensão coloidal isotrópica de bicelles, a orientação induzida pelo arranjo dos fosfolipídios na BICAMADA serão perdida, zerando o δ de retardo. O bicelles também deve alinhar a fim de orientar os fosfolípidos opticamente ativos em seus bilayers, causando um retardo δ da luz polarizada. Consequentemente, birrefringência é uma ferramenta sensível para quantificar a alignability magnética das assembleias de polymolecular. Bicelles alinhados perpendicular ao campo magnético renderá um positivo , enquanto aqueles alinhados paralelamente renderá um negativo . O sinal varia de acordo com o alinhamento da instalação e pode ser verificado com uma amostra de referência.