Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

Bicelles sono assembly polimolecolari discoidale ottenuti dalle numerose miscele di lipidi. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} essi sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di biomolecole di membrana tramite spettroscopia NMR. ^{6 , 7} tuttavia, i recenti sforzi mirano a espandere il campo delle possibili applicazioni. ^{5 , 8 , 9} il sistema di bicelle più studiato è composto da una miscela di 1,2-dimiristoil –sn– glicero-3-fosfocolina (DMPC), che costituiscono la parte piana dell’Assemblea e 1,2-dihexanoyl –sn– glicero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolipide che copre il bordo. ^{1 , 2 , 3} la geometria molecolare dei fosfolipidi che compongono il bilayer dettare l’architettura della struttura polimolecolari auto-assemblati. ^{4 , 5} sostituzione DHPC con DMPE-DTPA genera sistemi altamente magneticamente reattivo e sintonizzabile bicelle. ^{10 , 11} DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) bicelles associare con molti più ioni paramagnetici lantanidi (Ln^{3 +}) sulla superficie di doppio strato, conseguente a una risposta magnetica migliorata. ¹⁰ inoltre, sostituendo le molecole solubili in acqua di DHPC con^{3 +} consente di DMPE-DTPA/Ln la formazione di diluizione-resistente bicelles. ¹¹

La alignability magnetica di planare polimolecolari assembly è dettata dalla loro energia nel complesso magnetico,

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dove B è l’intensità del campo magnetico, il magnetico costante, n il numero di aggregazione e l’anisotropia diamagnetica molecolare suscettibilità dei lipidi che compongono il bilayer. Di conseguenza, la risposta di DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles ai campi magnetici è su misura dal loro formato (aggregazione numero n) e il Δχ di anisotropia diamagnetica molecolare di suscettibilità. Quest’ultima è realizzata prontamente modificando la natura del chelato Ln^{3 +}. ^{12 , 13 , 14 , 15} Introduzione colesterolo (Chol-OH) o altri derivati steroidi in doppio strato offre la possibilità di tuning sia il numero n di aggregato e la Δχ di suscettività magnetica degli assembly. ^{11 , 16 , 17 , 18 , 19} per una composizione lipidica determinato, grandi assemblee contengono più lipidi capaci di contribuire alla E_mag (più grande aggregazione numero n), con conseguente più regolabile in specie. La dimensione del DMPC/DHPC bicelles, ad esempio, convenzionalmente è controllata tramite l’ottimizzazione la composizione lipidica rapporto totale della concentrazione di o. ^{20 , 21 , 22} anche se questo è possibile in DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, loro trasformazione termo-reversibile da bicelle a vescicole su riscaldamento offerte aggiunto opzioni di sartoriale. Meccanica significa come estrusione attraverso filtri a membrana permette di modellare delle vescicole. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate sul raffreddamento a 5 ° C e le loro dimensioni sono dettate da precursori della vescicola. ¹¹ qui, ci concentriamo sul potenziale delle procedure di fabbricazione meccanica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) come sistemi di riferimento. Il processo funziona Analogamente quando si lavora con altri Ln^{3 +} Tm^{3 +}. L’ampia gamma di possibilità offerte da queste tecniche sono evidenziati in Figura 1 e ampiamente discussa altrove. ²³

Figura 1: Panoramica schematica delle procedure di fabbricazione possibile. Studiato magneticamente allineabile Ln^{3 +} chelante polimolecolari assembly sono composti da entrambi DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5). Il film lipidico asciutto è idratato con un tampone fosfato 50 mM ad un valore di pH di 7,4 e la concentrazione dei lipidi totale è di 15 mM. Un’efficace idratazione del film lipidico richiede sia congelare scongelamento cicli (FT) o riscaldamento e raffreddamento cicli (H & C). H & C cicli sono necessari per rigenerare i campioni dopo il gelo ultimo passaggio di scioglimento o per rigenerare i campioni tenuti congelati per un periodo prolungato di tempo, se devono essere usati senza ulteriore estrusione. Questi passaggi sono ampiamente discussa da Isabettini et al. ²³ al massimo allineabile polimolecolari assembly vengono raggiunti, offrendo architetture di assembly diverso sulla base della composizione lipidica. La dimensione di bicelle e la alignability magnetica è sintonizzabile per estrusione (Ext) attraverso filtri a membrana nanopore. L’allineamento presentato fattori A_f sono stati computati da modelli di dispersione (SANS) 2D angolo piccolo neutrone di un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) campione estruso attraverso 800, 400, 200 o 100 nm pori. SANS misurazioni sono un mezzo complementare di quantificare l’allineamento di bicelle che non verrà trattato in dettaglio nel presente documento. ^{11 , 16} l’A_f varia tra -1 (scattering di neutroni parallela o perpendicolare allineamento di bicelles rispetto alla direzione del campo magnetico) e 0 per scattering isotropo.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La struttura del bicelles è stata studiata estesamente da una vasta gamma di tecniche di caratterizzazione. ¹³ l’allineamento del bicelles esposti ad un campo magnetico è stato quantificato mediante spettroscopia NMR o esperimenti di scattering (SANS) angolo piccolo neutrone. ^{5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25} tuttavia, lo spostamento e l’ampliamento dei picchi NMR che si verificano in presenza di Ln^{3 +} sono gravi limitazioni al metodo. ^{15 , 26 , 27 , 28} sebbene SANS esperimenti non soffrono di questa limitazione, alternativa e tecniche più accessibili sono desiderabili per quantificazione sistematica di allineamento magneticamente indotta degli assembly nella soluzione. Birifrangenza misurazioni sono un’alternativa praticabile e relativamente semplice. Analogamente agli esperimenti NMR, birifrangenza misure rivelano preziose informazioni su riorganizzazioni del lipido e fasi del lipido che si verificano in doppio strato. Inoltre, vengono monitorate trasformazioni geometriche che si verificano nell’assembly polimolecolari con mutevoli condizioni ambientali come la temperatura. ^{11 , 12 , 13 , 16} Δn′ birifrangenza magneticamente indotta è stato utilizzato per studiare vari tipi di sistemi del fosfolipide. ^{13 , 29 , 30} misure di birifrangenza basate sulla tecnica della modulazione di fase in un campo magnetico è un metodo praticabile per rilevare l’orientamento del bicelles. ^{12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32} la possibilità di studiare bicelles con Birifrangenza in alti campi magnetici fino a 35 T inoltre è stata dimostrata da Liebi M. et al. ¹³

Quando la luce polarizzata entra un materiale anisotropo, esso sarà rifratti in un’ondata di ordinaria e straordinaria. ¹¹ le due onde hanno velocità differenti e sono spostate in fase di un δ di ritardo. Il grado di ritardo δ è misurato e convertito in un segnale di birifrangenza per quantificare il grado di anisotropia nel utilizzando materiale

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dove λ è la lunghezza d’onda del laser e d è lo spessore del campione. I fosfolipidi sono otticamente anisotropici e loro asse ottico coincide con le loro ascie lungo molecolare, parallele alle code dell’idrocarburo. ^{11 , 12} nessun ritardo è misurato se i fosfolipidi sono orientati in modo casuale in soluzione. Il ritardo è misurato quando i fosfolipidi sono allineati parallelamente a vicenda. La birifrangenza magneticamente indotta può avere un segno positivo o negativo a seconda dell’orientamento delle molecole nel campo magnetico; vedere la Figura 2. Fosfolipidi allineati parallelamente all’asse x si tradurrà in un negativo , mentre quelli allineati lungo l’asse z, che provocare un positivo . Nessun birifrangenza è osservata quando l’asse ottico coincide con la direzione di propagazione della luce come il fosfolipide allinea parallelo all’asse y.

Figura 2: Allineamento dei fosfolipidi e corrispondente segno della birifrangenza magneticamente indotta . Il segno di quella misurata dipende dall’orientamento del fosfolipide nel campo magnetico. Le linee tratteggiate indicano l’asse ottico della molecola. La luce è polarizzata a 45° e si propaga in direzione y. Il campo magnetico B è nella direzione z. Questa figura è stata modificata da M. Liebi. ¹¹ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel caso di una sospensione colloidale isotropica di bicelles, l’orientamento indotta tramite la disposizione dei fosfolipidi in doppio strato andranno perso, azzerando il δ di ritardo. Il bicelles inoltre deve allineare al fine di orientare i fosfolipidi otticamente attivi in loro strati lipidici, causando un ritardo δ della luce polarizzata. Di conseguenza, la birifrangenza è uno strumento sensibile per quantificare la alignability magnetica di polimolecolari assembly. Bicelles allineato perpendicolarmente al campo magnetico produrrà un positivo , mentre quelli allineati parallelamente produrrà un negativo . Il segno dipende l’allineamento dell’installazione e può essere controllato con un campione di riferimento.