Vi beskriver den optisk avbildning av möss som infekterats med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) använder reporter enzym fluorescens (REF). Detta protokoll underlättar det känsligt och specifikt påvisande av M. tuberculosis i prekliniska djurmodeller för patogenes, therapeutics och vaccin forskning.
Reporter enzym fluorescens (REF) använder tredjeparts substrat som är specifika för enzymer som förekommer i målorganismer av intresse för imaging eller detektering av fluorescens eller Mareld. Vi använder BlaC, ett enzym som konstitutivt framfört alla M. tuberculosis stammar. REF tillåter snabb kvantifiering av bakterier i lungorna av infekterade möss. Samma grupp av möss kan avbildas på många punkter, kraftigt minska kostnaderna, enumerating bakterier snabbare, så att nya observationer i värd-patogen interaktioner och ökande statistiska makt, eftersom fler djur per grupp lätt underhålls . REF är extremt känsligt katalytisk pågrund av BlaC enzymatisk reportern och specifikt på grund av de anpassade våglängdsområde resonans energiöverföringen (bandet) eller fluorogenic-substrat som används. REF kräver inte rekombinant stammar, att säkerställa normal värd-patogen interaktioner. Vi beskriver avbildning av M. tuberkulos infektion med bandet substrat med maximal utsläpp vid 800 nm. Våglängden av substratet kan känsliga djup vävnad imaging i däggdjur. Vi kommer att beskriva aerosol infektion i möss med M. tuberculosis, anestesi av möss, administration av REF substrat och optisk imaging. Denna metod har tillämpats framgångsrikt utvärderade värd-patogen interaktioner och effekt av antibiotika inriktning M. tuberkulos.
Den långsamma tillväxten M. tuberkulos är en stor vägspärr i snabb diagnos av tuberkulos1,2,3. Medan kultur baserad diagnos tar veckor att producera resultat, har syrafasta utstryk diagnostiska begränsningar4 barn5 och patienter Co-infekterade med humant immunbristvirus6,7. Optisk imaging teknik har nyligen erkänts som ett alternativ till traditionella diagnostiska metoder för tuberkulos8,9. Fluorescens och Mareld kan användas till optiskt bild M. tuberkulos hos levande djur i realtid10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Optisk imaging har fördelen av en snabb och specifik bedömning av en infektion med M. tuberculosis20,21,22.
Vi beskriva Detaljer för optisk imaging M. tuberkulos i levande möss använder REF. Denna metod är mycket specifika och känsliga23,24 och liknar andra optiska metoder, är mindre dyra än andra metoder för tuberkulos (tbc) imaging25, inklusive datortomografi (CT)26, magnetiska resonance imaging (MRI)27, och F-fluorodeoxyglucose positronemissionstomografi/CT (F-FDG PET/CT)28. REF använder tredjeparts anpassade fluorescerande eller självlysande substrat som vid klyvning av en bakteriell enzym, producerar en fluorescerande produkt8,29. Därför har det fördelen av att inte kräva en rekombinant mykobakteriella reporter stam30,31. FRET substratet beskrivs består av en fluorokrom och en törstsläckare som förbinds med en β-laktam-ring som hydrolyseras av BlaC (β-laktamas), naturligt konstitutivt uttryckta av tuberkulos-komplex Mycobacterium8, 32. bakterierna direkt generera signal på grund av REF katalytisk aktivitet som gör att förstärkning av många storleksordningar och känslig detektion av M. tuberkulos.
Det REF substrat som används i denna studie har utmärkt vävnad penetration i levande djur och minskat bakgrund på grund av dess långa våglängd. Med detta lång våglängd substrat är det möjligt att uppnå ett tröskelvärde för upptäckt för M. tuberculosis nästan 100 kolonibildande enheter (CFU) i vitro och < 1000 CFU i lungorna av möss i vivo (hela djur)8, 33. REF kan användas som ett diagnostiskt verktyg för sputum, kliniskt material och även direkt hos patienter med micro endoskopisk system16,32,33,34 på grund av dess höga känslighet och specificitet. REF kan tillämpas på någon tuberkulos kliniska stam, eftersom den använder ett naturligt producerat bakteriell enzym, BlaC, för detektering i alla stammar. Dessa egenskaper gör REF imaging ett värdefullt verktyg i prekliniska tuberkulos forskning i allmänhet för att underlätta terapeutiska samt vaccin utvärdering och analys av patogenes, men också i slutändan får tillämpas på diagnos i tuberkulos patienter.
När du använder avbildningstekniker, såsom REF, finns det viktiga strategier som tillåter generation av robusta och konsekventa uppgifter. Optisk imaging producerar spritt ljus i vävnader vilket kan påverka inträngningsdjupet, eftersom det är svårt att fånga ljuset i alla riktningar. Användning av en nära infraröd fluorophore (NIR) substrat för REF imaging med en excitation och utsläpp våglängd i Querange 700-900 nm underlättar minimal absorption av fluorescerande signalen från däggdjur vävnader. Anpassade utformade substratet konstruerades genom att länka en NIR fluorophore, IRDye 800Cw till en törstsläckare, IRDye QC-1, av en lactam ringen ger fluorescens resonans energi överföring-baserade snabbkylning. IRDye har utmärkt vävnad penetration och ljus spridning egenskaper och har inte någon uppenbar skadlig effekt på däggdjur36, rensas från blod och organ av 24 h. fluorescens signal betydligt ökar börjar 4 h efter substratet administration, nå en maximal nivå 6 h efter administrering.
Bakteriella infektionssjukdomar dosen, funktionsläget av administrering av smittsam dos och substrat samt tidpunkter Imaging post infektion genom att utföra pilotstudier bör standardiseras innan man börjar på stora, komplexa, experiment. Pilotstudier kan avsevärt minska tiden och kostnaden när imaging ett stort antal djur eftersom ett standardförfarande kan optimeras innan du gör det viktigaste experimentet. Bakteriella laster bör bestämmas i organ/vävnader av intresse efter hela kroppen imaging använder trans-belysning och ex vivo lung bildåtergivning med epi-belysning att validera källan av signalen och bestämma kvaliteten på korrelation med bakteriell nummer närvarande8. Pilotstudier kommer att ge inblick i tröskeln till upptäckt, dynamiskt omfång av tekniken samt bestämning av optimala experimentella förutsättningar för avbildning.
De främsta fördelarna med att använda REF imaging som jämfört med andra lysrör och självlysande strategier är dess höga känslighet och förmåga att bild naturliga M. tuberculosis stammar. REF imaging använder tredjeparts enzymet katalytiskt robust BlaC som är bevarad i alla M. tuberculosis kliniska isolat och tuberkulos-komplex stammar. Stor känslighet REF imaging beror på den katalytiska snabbt BlaC i kombination med bibehållande av klyvs fluorescerande produkten av värdcellen. Signalera kontinuerligt ökar så länge underlaget är tillgängliga vilket resulterar i nästan obegränsade uppbyggnaden av signalen inom infekterade celler och vävnader. Denna ökade känslighet för REF imaging jämfört med alternativa metoder för imaging tillåter specifika påvisande av M. tuberculosis både in vitro- och in-vivo8,23,24, 29.
REF imaging kan användas för bakteriell upptäckt utan genetiska modifieringar möjliggör dess direkta tillämpning till någon infektion modell, antingen laboratorium djur8,37 eller mänskliga kliniska material29,38 . REF kan användas för att upptäcka och bild ett brett spektrum av patogener39,40, eftersom fluorogenic substrat kan utvecklas för många enzymatiska mål än BlaC såsom proteaser, kinaser, ureases och β-galactosidases. Dock försiktig målet bör övervägas för att säkerställa det visar optimala egenskaper för avbildning. BlaC representerar en bra modell enzym för egenskaper som kommer att säkerställa framgångsrik tillämpning av denna strategi. REF imaging ger en omedelbar avläsning på bakteriehalten i lungorna under infektioner, vilket avsevärt snabbar framsteg i studie av tuberkulos patogenes, eftersom fastställandet av bakteriell siffror kräver normalt tre till sex veckor, men även i mer snabb-växande organismer detta tillvägagångssätt kommer att spara mycket tid. REF kan också användas för att diskriminera carcinom från tuberkulos, ett nyckelproblem diagnos av nodulär lesioner i patienter41,42. REF fungerar som ett nytt verktyg att påskynda translationell tuberkulos imaging och kan även tillämpas på människor, vilket kan möjliggöra snabb förutsägelse av terapeutiska resultat.
Isoflurane | VETONE | 501027 | |
CNIR800 | Custom synthesized | ||
Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
Sporcidin | RE-1284F | ||
7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
Madison Chamber | |||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |