マイコバクテリウムの結核(結核) レポーター酵素蛍光 (REF) 感染マウスの光イメージングについて述べる。このプロトコルは、病因、治療薬やワクチンの研究前臨床動物モデルで結核の特異的かつ高感度検出を容易します。
レポーター酵素蛍光 (REF) は、酵素、イメージングや蛍光または発光による検出興味のターゲット有機体の存在のために特定、基板を採用しています。BlaC, すべての結核菌によって恒常発現酵素を利用します。REF では、感染マウスの肺での細菌の迅速な定量をことができます。マウスの同じグループのイメージを作成、大幅コスト削減より迅速に細菌を列挙する、宿主-病原体相互作用の新しい観察をできるように、グループごとのより多くの動物が容易に維持されますので、統計的検出力を増やす多くの時点で.REF は、非常にカスタム蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) または使用される蛍光基板による特異的かつ高感度 BlaC 酵素記者の触媒の性質のためです。REF には、組換え系統を必要はありません通常宿主-病原体相互作用を確保します。800 で最大放出でフレット基板を用いた結核感染症のイメージングについて述べる nm。基板の波長は、哺乳類の敏感な深部組織イメージングをことができます。我々 は、結核マウスの麻酔、REF 基板と光イメージングの投与マウスのエアロゾル感染を概説します。このメソッドは、正常にホスト病原体の相互作用および結核を対象と抗生物質の有効性の評価に適用されています。
結核の低成長率は、結核1,2,3の迅速診断の主要な障害です。文化に基づいて結果を生成する診断は数週間、抗酸菌の塗抹標本は子供5およびひと免疫不全ウイルス6、7の同時感染患者の診断限界4 。光学イメージング技術は、最近結核8,9の伝統的な診断法に代わるものとして認識されています。蛍光と発光リアルタイム10、11,12,13,14、生きている動物の結核の光学イメージを使用できます。 15,16,17,18,19。光イメージング結核20,21,22による感染症の迅速かつ特定評価の利点があります。
結核のライブ REF を使用してマウスに光イメージングの詳細をまとめました。このメソッドは非常に特定および敏感な23,24他光学的な方法と同様、小さい結核 (TB) イメージング25、コンピューター断層撮影 (CT)26、磁気を含む他の方法よりも高価な共鳴イメージング (MRI)27日、F f-フルオロデオキシグル コース ポジトロン断層法/CT (F-FDG PET/CT)28。REF は、細菌の酵素によって胸の谷間に蛍光製品8,29を生成するカスタムの蛍光または発光基板を採用しています。したがって、遺伝子組換え抗酸菌記者ひずみ30,31を必要としないという利点があります。記載されているフレット基板は、螢光色素と BlaC (β-ラクタマーゼ)、自然発現を複雑で結核菌8,によって示した、加水分解は β ラクタム リングによって接続クェンチャー成る32. 細菌が直接多くの桁違いと結核の高感度検出による増幅を可能にする REF の触媒活性により信号を生成します。
本研究で使用される REF 基板は、優れた組織は、生きている動物と波長が長いためバック グラウンドを低減します。この長い波長の基板とそれはほぼ 100 の結核の検出のしきい値を達成するために可能なコロニー形成単位 (CFU)の in vitroと < マウス生体内で(全体の動物) の8、肺で 1000 CFU 33。REF は、喀痰、臨床材料とも直接マイクロ内視鏡システム16,32,33,34高い感度と特異性のための患者、診断ツールとして使用できます。REF は、すべて株の存在検知の自然生成細菌の酵素、BlaC を使用しているために、任意の結核の臨床株に適用できます。これらの特性治療を容易にする前臨床結核研究に貴重なツールを一般的なイメージング REF ワクチン評価と病因の解析も最終的に結核の診断に適用することがありますが患者。
REF などのイメージング技術を使用して堅牢で一貫性のあるデータの生成を許可する主な戦略があります。光イメージングには、すべての方向に放射された光をキャプチャすることは困難だために浸透の深さに影響を与えることができます組織内散乱光が生成されます。使用近赤外蛍光 (NIR) の REF 700 〜 900 nm の Querange の励起・発光波長を持つイメージング用基板の哺乳類ティッシュの蛍光信号の最小吸収が容易になります。カスタム設計された基板は、逆に近赤外蛍光体、IRDye 800Cw をリンクによって建てられた IRDye QC-1、蛍光共鳴エネルギー移動に基づく消光を許可するラクタム環によって。IRDye は優れた組織浸透と光散乱特性と哺乳類の36に明らかに有害な影響がない、血および器官から 24 時間蛍光によってクリアされる後 4 h が増加の信号大幅基板管理、投与後 6 h のレベル最大に達する。
細菌感染用量、感染用量及び基板の管理だけでなく、パイロット研究を実行することにより感染症の記事をイメージングの時間ポイントのモードでは、大規模で複雑な実験に着手する前に標準化しなければなりません。キーの実験を行う前に標準的な手順を最適化することができますので、大量の動物をイメージングするとき、パイロット研究には時間とコスト大幅削減できます。全身画像透過照明とex vivo肺イメージング射を使用して信号のソースを検証して、相関の品質を決定するを使用して、次の興味の臓器・組織に細菌負荷を確定すべき細菌数現在8。パイロット研究では、検出のしきい値、テクニックのダイナミック レンジだけでなく、イメージングに最適な実験条件の決定に洞察を提供します。
高感度測定と自然な結核をイメージする能力としてイメージング REF を使用する主な利点は、他の蛍光・発光の戦略と比較して系統。REF イメージングは、すべての結核臨床分離菌株および結核複雑な系統の保存されている BlaC の堅牢な触媒の酵素を利用しています。イメージング REF の偉大な感度は、触媒急速 BlaC の組み合わせで宿主細胞によって裂かれた蛍光製品の保持とによるものです。基板が感染した細胞や組織内の信号のほぼ無限の蓄積で利用できる限り、増加信号継続的に。イメージング REF のこの高められた感度イメージングの代替的なアプローチと比べてにより結核の特異的検出両方生体外および生体内の8,23,24、 29。
遺伝的変更の任意の感染モデル、いずれ研究室動物8,37または人間の臨床材料29,38の直接適用を有効にすることがなく細菌検出用イメージング REF を使用できます。.検出し、画像のさまざまな病原体39,40, プロテアーゼ、キナーゼ、ウレアーゼ、β ガラクトシダーゼなど BlaC 以外多数の酵素のターゲットの蛍光基板を開発することができますので、REF が使用されます。しかし、思想は、ことを確認するためにターゲットに与えられるべき注意が表示されますイメージングのための最適な特性。BlaC は、この戦略の成功のアプリケーションを確保する特性の良いモデル酵素を表します。イメージング REF 即時読み出し細菌負荷の肺に存在時に説明します感染症、結核の病因、細菌数の測定は通常 3 〜 6 週間を必要とするための研究が、均等に大きく進行状況を高速化このアプローチは大いに節約急速成長生物の時間。結核患者41,42で結節性病変の診断の重要な問題から癌を区別するために、REF を使用またできます。REF は並進結核イメージングを加速するための新しいツールとして機能し、潜在的治療成果の迅速な予測をできるように、人間にも応用できます。
Isoflurane | VETONE | 501027 | |
CNIR800 | Custom synthesized | ||
Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
Sporcidin | RE-1284F | ||
7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
Madison Chamber | |||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |