Vi beskriver den optiske billeddannelse af mus inficeret med Mycobacterium tuberculosis (M. tuberkulose) ved hjælp af reporter enzym fluorescens (REF). Denne protokol letter følsom og specifik påvisning af M. tuberkulose i prækliniske dyremodeller for patogenesen, therapeutics og vaccine forskning.
Reporter enzym fluorescens (REF) udnytter substrater, der er specifikke for enzymer til stede i målorganismer af interesse for imaging eller afsløring af fluorescens eller bioluminescens. Vi udnytte BlaC, en enzym udtrykt constitutively af alle M. tuberkulose stammer. REF giver mulighed for hurtig kvantificering af bakterier i lungerne af inficerede mus. Den samme gruppe af mus kan være afbildet på mange tidspunkter, høj grad at reducere omkostningerne, optæller bakterier hurtigere, tillader roman observationer i vært-patogen interaktioner og øge statistiske effekt, da flere dyr pr. gruppe er let vedligeholdes . REF er ekstremt følsomme på grund af BlaC enzymatisk reporter katalytisk karakter og specifikke på grund af den brugerdefinerede flourescence resonans energioverførsel (FRET) eller fluorogenic substrater anvendes. REF kræver ikke rekombinant stammer, sikre normale vært-patogen interaktioner. Vi beskriver billeddannelse af M. tuberkulose -infektion ved hjælp af en FRET substrat med maksimal emission på 800 nm. Bølgelængden af underlaget tillader følsomme dybe væv imaging i pattedyr. Vi vil skitsere aerosol infektion af mus med M. tuberkulose, anæstesi i mus, administration af REF substrat, og optiske billeddannelse. Denne metode har været anvendt med succes til evaluering af vært-patogen interaktioner og effekten af antibiotika målrette M. tuberkulose.
Den langsomme vækst i M. tuberkulose er en stor vejspærring i hurtig diagnose af tuberkulose1,2,3. Mens kultur baseret diagnosticering tager uger til at producere resultater, har syrefaste smøre diagnostisk begrænsninger4 børn5 og patienter co-inficerede med human immundefekt virus6,7. Optisk tænkelig teknologier er for nylig blevet anerkendt som et alternativ til traditionelle diagnostiske metoder for tuberkulose8,9. Fluorescens og bioluminescens kan bruges til optisk billede M. tuberkulose med levende dyr i real-time10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Optiske billeddannelse har fordel af en hurtig og specifik vurdering af en infektion med M. tuberkulose20,21,22.
Vi skitsere detaljer for optiske billeddannelse af M. tuberkulose i levende mus bruger REF. Denne metode er meget specifikke og følsomme23,24 , og i lighed med andre optiske metoder, er mindre dyre end andre metoder af tuberkulose (TB) imaging25, herunder computertomografi (CT)26, magnetisk resonans imaging (MR)27, og F-fluorodeoxyglucose positronemissionstomografi/CT (F-FDG PET/CT)28. REF benytter brugerdefinerede fluorescerende eller en bioluminescerende substrater, der ved spaltning af en bakteriel enzym, producerer en fluorescerende produkt8,29. Derfor, det har fordelen, der ikke kræver en rekombinant mykobakterielle reporter stamme30,31. FRET substrat beskrevet består af en fluorokrom og en quencher forbundet ved et β-lactam-ring, der er hydrolyseret af BlaC (β-lactamase), naturligt constitutively udtrykt ved tuberkulose-kompleks Mycobacterium8, 32. bakterierne direkte generere signal på grund af REF katalytisk aktivitet, der giver mulighed for forstærkning af mange størrelsesordener og følsomme påvisning af M. tuberkulose.
REF substrat anvendes i denne undersøgelse har fremragende væv penetration i levende dyr og reduceret baggrund på grund af dens lang bølgelængde. Med denne lang bølgelængde substrat er det muligt at opnå en tærskel på registrering af M. tuberkulose på næsten 100 kolonidannende enheder (CFU) in vitro- og < 1000 CFU i lungerne på mus i vivo (hele dyr)8, 33. REF kan bruges som et diagnostisk redskab for sputum, kliniske materialer og endda direkte hos patienter med mikro endoskopiske systemer16,32,33,34 høj følsomhed og specificitet. REF kan anvendes på enhver tuberkulose kliniske stamme, fordi det bruger en naturligt producerede bakteriel enzym, BlaC, til registrering i alle stammer. Disse egenskaber gør REF imaging et værdifuldt værktøj i prækliniske tuberkulose forskning generelt for at lette terapeutiske samt vaccine evaluering og analyse af patogenese, men kan også i sidste ende anvendes til diagnose i tuberkulose patienter.
Når ved hjælp af Billeddannende teknikker, såsom REF, er der centrale strategier, der tillader generation af solide og sammenhængende data. Optiske billeddannelse producerer spredt lys i væv, som kan påvirke dybde af penetration, da det er svært at fange lys udsendes i alle retninger. Brug af en i nærheden af infra-røde fluorophore (NIR) substrat for REF imaging har en excitations- og bølgelængde i Querange af 700-900 nm letter minimal absorption af fluorescerende signal af mammale væv. Den brugerdefinerede designet substrat blev bygget ved at sammenkæde en NIR fluorophore, IRDye 800Cw med en quencher IRDye QC-1, af en laktamringe tillader fluorescens resonans energi transfer-baseret dæmper. IRDye har fremragende væv penetration og lys spredning karakteristika og ikke har nogen indlysende skadelige virkning på pattedyr36, bliver ryddet fra blod og organer af 24 h. fluorescens signal betydeligt øger begynder 4 h efter substrat administration, at nå maksimal niveauer 6 timer efter indgift.
Bakteriel infektiøse dosis, tilstand af administration af infektiøse dosis og substrat samt tidspunkter af imaging efter infektion ved at udføre Pilotundersøgelserne skal være standardiseret før man indlader sig på store, komplekse, eksperimenter. Pilotundersøgelserne kan reducerer tid og omkostninger Når imaging et stort antal dyr, fordi en standard procedure kan optimeres forud for at gøre den centrale eksperiment. Bakteriel belastninger bør fastlægges i organer/væv af interesse efter hele kroppen imaging ved hjælp af trans-belysning og ex vivo lunge billeddannelse ved epi-belysning til at validere kilde af signalet og bestemme kvaliteten af korrelation med bakteriel numre nuværende8. Pilotundersøgelser vil give indsigt i tærsklen til påvisning, dynamikområde af teknik og bestemmelse af de optimale eksperimentelle betingelser for billeddannelse.
De primære fordele ved at bruge REF imaging som i forhold til andre fluorescerende og en bioluminescerende strategier er dens høje følsomhed og evne til at billede naturlige M. tuberkulose stammer. REF imaging udnytter katalytisk robust enzymet BlaC der er bevaret i alle M. tuberkulose kliniske isolater og tuberkulose-komplekset stammer. Den store følsomhed af REF imaging er på grund af den hurtige katalytiske sats af BlaC i kombination med fastholdelse af cellen vært kløvet fluorescerende vare. Signal løbende stigninger, så længe substratet er til rådighed, hvilket resulterer i næsten ubegrænsede ophobning af signal i de inficerede celler og væv. Denne øget følsomhed af REF imaging i forhold til alternative tilgange Imaging giver specifik påvisning af M. tuberkulose både in vitro- og i vivo8,23,24, 29.
REF imaging kan bruges til registrering af bakteriel uden genetiske modifikationer gør det muligt for dens direkte anvendelse på enhver infektion model, enten laboratorium dyr8,37 eller humane kliniske materialer29,38 . REF kan bruges til at registrere og image en bred vifte af patogener39,40, da fluorogenic substrater kan udvikles for talrige enzymatisk mål end BlaC såsom proteaser, kinaser, ureases og β-galactosidases. Men forsigtig, man bør overveje at målet for at sikre det viser optimale egenskaber for billeddannelse. BlaC udgør en god model enzym for karakteristika, der vil sikre en vellykket anvendelse af denne strategi. REF imaging giver en øjeblikkelig udlæsning på bakteriemængde stede i lungerne under infektioner, hvilket stærkt øger fremskridt i undersøgelsen af tuberkulose patogenese, da bestemmelsen af bakteriel numre kræver normalt tre til seks uger, men selv i mere hurtig-voksende organismer denne tilgang vil spare meget tid. REF kunne også bruges til at diskriminere karcinomer fra tuberkulose, et centralt problem i diagnosticering af nodulær læsioner i patienter41,42. REF fungerer som en roman værktøj til at fremskynde translationel tuberkulose imaging og kan endda anvendes på mennesker, potentielt giver mulighed for hurtig forudsigelse af terapeutiske resultater.
Isoflurane | VETONE | 501027 | |
CNIR800 | Custom synthesized | ||
Fatal Plus solution | Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd | ||
7H9 Middlebrook broth | BD | 271310 | |
OADC Middlebrook enrichment | BD | 212351 | |
Sporcidin | RE-1284F | ||
7H11 Middlebrook Agar | BD | 212203 | |
Madison Chamber | |||
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
XGI-8-gas Anesthesia System | Perkin Elmer | ||
Living Imaging software | Perkin Elmer | ||
Transparent nose cones | Perkin Elmer | ||
M. tuberculosis strain CDC1551 | ATCC | ||
Female BALB/C mice, 5-7 weeks | Jackson Laboratory |