Γ-Secretase 중재 녹말 체 선구자 단백질 및 세포 기반 Luciferase 기자 시험 플랫폼에 노치 분열의 정량적 측정

아 밀 로이드 β (Aβ)의 oligomeric 모양은 neurodegeneration Alzheimer의 질병 (광고)¹에서 고통 받는 환자의 두뇌에서의 주요 원인이 될 것으로 추정 된다. Aβ 펩 티 드 그리고 γ-secretase²β-secretase에 의해 처음으로 녹말 체 선구자 단백질 (APP)의 stepwise 분열에 의해 생산 됩니다. 지난 10 년간에서 광고의 치료로 치료 접근 Aβ 생산³의 예방에 집중 했다. 연구의 대부분은 애플 리 케이 션의 γ-secretase 분열을 배제 하 고 그로 인하여 Aβ의 생산 또는 β-및/또는 γ-secretase 활동⁴의 금지를 감소 수 있는 α-secretase 활동의 확대에 집중 했다. 불행히도, 피할 수 없는 부작용에 β 또는 γ secretases 결과의 비 선택적인 억제는 β와 γ-secretase^5,6의 다른 생리 적인 기판의 기능 방해 예정 이다. Γ-secretase 억제제에 관한 최근 연구 화학 및 유전 변조기 노치^{7의 필수적인 γ-secretase 중재 처리에 사소한 영향을 발휘 하는 동안 Aβ 생산을 통제할 수 있는 수의 발견 보고 그러나 ,,89,10,11,12},, 성공적인 치료 아직 개발 하지 않은. 따라서, 더 체계적인 스크린은 보증 소설 유전과 화학 한정자 선택적으로 γ-secretase 중재 애플 리 케이 션 처리를 조절 수 있습니다 발견.

Γ-Secretase 이상의 90 다른 막 정박 단백질을 쪼개로 알려져 있다. 이러한 기판 중 그 활동은 세포 운명 결정과 분화 개발¹³과정에 대 한 중요 한 단계가입니다. 선택적으로 변조 γ-secretase 촉매 응용 프로그램 부재에 처리에 영향을 미치는 노치의 처리 부작용에 대 한 최소화 노치 관련 γ-secretase 억제제의 필수적인 되며이 선택도 기본 요소가 될 것으로 생각 됩니다. 광고의 만성 치료에 대 한 잠재적인 γ-secretase 변조기의 생물학적 효능을 지정 합니다. 다양 한 arylsulfonamide 유도체, GSI-953 (begacestat) 등 BMS-708163 (avagacestat), γ-secretase^14,15의 강력 하 고 선택적인 억제를 전시 발견 되었습니다 되었습니다. 이전 연구는 APP와 노치의 γ-secretase 분열의 차동 저해 조합 vivo에서 유효성 검사 zebrafish¹⁶를 사용 하 여 양이 많은 ELISA 기반 분석 결과 사용 하 여 관찰 될 수 있다 설명 했다. 또한, 세포 기반 분석 결과 패러다임 γ-secretase 애플 리 케이 션 및 노치^17,18대의 잠재적인 기판 선택도 해결 하기 위해 설립 되었습니다. 여기 설명한 비슷한 프로토콜을 사용 하 여, 우리는 최근에 발견 (D)의 소설 클래스-potently 노치를 살려주는 선택도¹⁹APP의 γ-secretase 분열을 조절 하는 leucinamides. 함께,이 연구의 제공의 증거-개념 γ-secretase의 기판 선택/가용성 화학 변조 및 실험 검증 대상이 될 수 있는 개념을 지 원하는 됩니다. 그러나, 이러한 분석 결과 플랫폼 종종 상대적으로 낮은 처리량 판독 및 약물 발견 프로그램에 대 한 산업 표준에 맞지 수 있습니다 노동 집약적인 접근에 의존 합니다.

우리는 최근 셀 기반 luciferase 취재 원 유전자 분석 실험 양적 γ-secretase 두 가지 기판, APP (응용 프로그램-C99)의 99 아미노 산 성 C 터미널 단편과는 세포 외의 촉매 활동을 확인할 수 있는 생성 된 도메인 삭제 노치 펩 티 드 (NΔE)입니다. 애플 리 케이 션-C99 및 NΔE γ-secretase 다양 한 분석 실험에서의 직접 기판으로 널리 사용 되었습니다 있다. 균일 하 고 일관 된 luciferase 리포터 유전자 분석 애플 리 케이 션-C99 또는 NΔE의 γ-secretase 분열에 대 한 생성, 우리 생성 한 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (CG) constitutively Gal4 발기인 구동 반딧불 luciferase 기자 (표현 하 Gal4-Luc)와 Gal4/VP16 태그 애플 리 케이 션-C99 융합 단백질 (C99-GV). 또한, constitutively Gal4 루크와 Gal4/VP16 태그 NΔE (NΔE-GV)를 표현 하는 또 다른 HEK 파생 안정적인 셀 라인 (NG)를 생성 했습니다. 이러한 새로운 기판 전용 γ-secretase 분석 실험을 사용 하 여, 우리 이제 계량 하 고 γ-secretase 별개 기판 (애플 리 케이 션-C99 CG 세포에서) 또는 NG 셀에 NΔE로의 촉매 활동을 구별 하는 방법을 제공 합니다. 또한, 기판 전용 γ-secretase 분석 실험이 콘텐츠 심사 플랫폼에 도움이 되도록 설계 되었습니다. 이 새로 생성 된 γ-secretase 분석 도출 다음-세대 치료에 대 한 바람직하지 않은 노치 저해 하지 않고 Aβ 생산을 억제 하 여 인지 기능을 향상 시킬 수 있습니다. 있는 소설 γ-secretase 변조기의 발견에 대 한 길을 닦은 수 있습니다. 광고.