基于细胞荧光检测平台的γ-分泌介导的淀粉样前体蛋白和缺口裂解的定量测定
Summary
我们已经成功地生成了两个基片特定的γ-分泌检测。这两种基于细胞的检测方法都被设计成通过萤火虫荧光记者的输出来量化γ-分泌酶的活性。
Abstract
我们已经开发了一对细胞为基础的记者基因检测, 定量测量γ-分泌分裂的不同基质。本手稿描述的程序, 可用于监测γ-分泌介导的 APP-C99 或缺口, 使用 Gal4 启动器驱动的萤火虫荧光记者系统的裂解。染 HEK293 细胞与 Gal4-driven 荧光报告基因和 Gal4/VP16-tagged C 终端片段 (APP-C99) 建立了稳定的 co-非晶胞蛋白的测定。CG 细胞), 或 Gal4/VP16-tagged 缺口-δ (NΔE;NG 细胞)。利用这些记者并行分析, 我们已经证明, ErbB2 抑制剂, CL-387,785, 可以优先抑制γ分泌分裂的 APP-C99 在 CG 细胞, 但不是 NΔE 在 NG 细胞。CL-387,785 治疗时, CG 和 NG 细胞所表现的差异反应是γ-分泌调节剂的首选特性, 这些反应与 DAPT 诱导的γ-分泌的泛抑制形成了鲜明的对比。我们的研究提供了直接的证据证明γ-分泌活动向不同的基底可以被区分在一个细胞的背景。因此, 这些新的化验方法可能是药物发现的有用工具, 用于改进 AD 疗法。
Introduction
聚的淀粉样β (a) 的形式被认为是导致阿尔茨海默氏病 (AD)1患者大脑中神经的主要原因。a 肽是由淀粉样前体蛋白 (APP) 的逐步裂解产生的, 首先是β-分泌, 然后是γ-分泌2。在过去的十年中, 治疗 AD 的治疗方法侧重于预防 a 的生产3。大多数研究都集中在α-分泌活性的增强上, 这可以排除应用的γ-分泌分裂, 从而减少 a 的产生, 或抑制β和/或γ-分泌活动4。不幸的是, 非选择性抑制β或γ-secretases 导致不可避免的副作用, 这是由于干扰功能的其他生理基质的β和γ-分泌5,6。关于γ-分泌抑制剂, 最近的研究报告发现了一些化学和遗传调节剂, 可以调节 a 的生产, 而对必要的γ-分泌介导的加工缺口的影响微不足道的7 ,8,9,10,11,12, 但是, 成功的治疗方法尚未开发。因此, 有必要进一步系统的屏幕, 以发现新的遗传和化学修饰, 可能选择性地调节γ-分泌介导的应用程序处理。
γ-分泌是已知的切割超过90种不同的膜锚定蛋白。在这些基体之中是切口, 它的活动是关键的细胞命运决心和分化在发展期间13。在没有影响缺口处理的情况下, 选择性地调节γ-分泌-催化的应用处理, 对于最小化γ-分泌抑制剂的缺口相关副作用至关重要, 而这种选择性被认为是一个主要因素, 将规定了潜在的γ-分泌调节剂对 AD 慢性治疗的生物学功效。有许多 arylsulfonamide 衍生物, 例如 GSI-953 (begacestat) 和 BMS-708163 (avagacestat), 被发现表现出强有力的和有选择性的抑制γ-分泌14,15。先前的一项研究表明, 使用定量 ELISA 法结合使用斑马鱼16的活体验证, 可以观察应用和切口的γ-分泌裂解的差异抑制。此外, 建立了基于细胞的检测范式, 以解决γ-分泌对 APP 和凹槽1718的潜在基底选择性。使用类似于本文所述的协议, 我们最近发现了一种新的类 (D)-leucinamides, 能调制的γ-分泌分裂的应用程序与缺口备用选择性19。这一集合的研究提供了一个证明的概念, 支持的概念, 基板的选择性/可用性γ-分泌可以受到化学调制和实验验证。然而, 这些化验平台往往依赖相对较低的吞吐量读数和劳动密集型的方法, 可能不符合工业标准的药物发现计划。
我们最近生成了基于细胞的荧光报告基因检测, 可以定量地确定γ-分泌对两个不同基底的催化活性, 即应用 (APP-C99) 的 99-氨基甲酸 C 末端片段和胞外域删除的缺口肽 (NΔE)。APP-C99 和 NΔE 在各种测定方法中被广泛用作γ-分泌的直接基质。为了生成均匀和一致的荧光报告基因检测的γ-分泌分裂的 APP-C99 或 NΔE, 我们产生了一个 HEK 衍生稳定细胞线 (CG) 组成表达 Gal4 启动驱动萤火虫荧光记者 (Gal4-Luc) 和 Gal4/VP16-tagged APP-C99 融合蛋白 (C99-GV)。此外, 我们还生成了另一个 HEK 的稳定细胞系 (NG), 组成表达 Gal4-Luc 和 Gal4/VP16-tagged NΔE (NΔE)。利用这些新的基质特异γ-分泌测定方法, 我们现在提供了一种定量和区分γ-分泌对不同基底 (APP-C99 在 CG 细胞中, 或 NΔE 在 NG 细胞中) 的催化活性。此外, 基板特定的γ-分泌检测的目的是有利于高含量的筛选平台。这些新生成的γ-分泌检测方法可以为发现新的γ-分泌调节剂铺平道路, 通过抑制 a 的产生, 而不引起对下一代治疗的不良抑制, 从而提高认知功能。的广告。
Protocol
Representative Results
Discussion
在 ad 的 aducanumab 免疫治疗的1b 期试验中, 有希望的结果已经牢固确立了 a 在 ad22发病机制中的关键作用, 并认为反 a 方法仍然是开发抗 ad 药物的可行策略。在这里, 我们描述了以细胞为基础的定量分析γ-分泌催化水解 APP-C99 和 NΔE 使用萤火虫荧光报告系统。APP-C99 和 NΔE 是两个最有研究的γ-分泌基底, 同时代表γ-分泌13的致病和生理活动。我们的发现, 下调 ErbB2 的…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢中央研究院细胞与有机体生物学研究所的核心设施, 以提供技术支持。这项研究得到了台湾科学技术部的支持 (最多 103-2320-001-016-MY3 至 Y。L.), 生物制药发展的转化创新方案–技术支持平台轴方案 (NP7 至 y.—), 中央研究院 (对 y—)。
Materials
| VictorLight luminescence plate reader | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Class II, Type 2 Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | main compnent of growth medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidin | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Hygromycin B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocytomer | Sigma-Aldrich | BR717805 Aldrich | |
| 96-well microplate | Nunc | 156545 | |
| Tetracycline | Sigma | T7660 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Steady-Glo luciferase assay reagent | Promega | E2510 | |
| Humidified CO2 incubator | Revco | Ultima II | |
| T-REx293 cell line | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software version 3.0 | PerkinElmer | instrument control software of the luminescence microplate reader |
Referencias
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