Här presenterar vi ett protokoll för att massproducera nedtystning murina NK-celler med hjälp av en feeder-fri differentiering system för mekanistiska studier in vitro och in vivo.
Natural killer (NK) celler tillhör det medfödda immunförsvaret och är en första linjens anti-cancer immunförsvar; men de undertryckta i den tumör närmiljön och den underliggande mekanismen är fortfarande till stor del okända. Bristen på en konsekvent och pålitlig källa av NK-celler begränsar de forskningsframsteg NK cell immunitet. Vi rapporterar här, en in vitro- system som kan tillhandahålla hög kvalitet och kvantitet av benmärgen-derived murina NK-celler under ett feeder-fria tillstånd. Viktigare, Visa vi också att siRNA-medierad nedtystning framgångsrikt hämmar E4bp4-beroende NK cell mognad med detta system. Denna nya in vitro- NK cell differentiering systemet är således en biomaterial lösning för immunitet forskning.
Cancer progression är beror på tumören mikromiljö1,2, inklusive värd-derived immunceller, t.ex., NK-celler. Flera studier har visat att intratumoral NK-celler är negativt korrelerade med tumör progression3,4. Kliniska studier visade dessutom att NK adoptiv cellterapi är en möjlig strategi för cancer5,6,7,8,9. NK cell-baserad cancer immunoterapi föreslogs nyligen som behandlingsalternativ för solida tumörer, men utmaningar finns på grund av utsöndringen av immunsuppressiva cytokiner och nedreglering av aktivera ligander i närmiljön av solida tumörer 10,11. Omvandla tillväxt factor-β (TGF-β) har föreslagits att en suppressiv roll i carcinogenes, men paradoxalt nog cancerceller också producera TGF-β1 för att stödja den tumör utveckling12,13,14 , 15. TGF-β signalering kan undertrycka NK celler via ned-reglerande interferon lyhördhet och CD16-medierad interferon-gamma (IFN-γ) produktion in vitro-16,17, cytolytisk aktivitet 18.
Även om störningar av TGF-β signalering i den tumör närmiljön kan vara en möjlig väg för att eliminera cancer, kommer att helt blockerar TGF-β signalering orsaka autoimmuna sjukdomar på grund av dess anti-inflammatoriska funktion, vilket framgår av utvecklingen av negativa biverkningar inklusive systemisk inflammation, modellerar kardiovaskulära defekter och autoimmunitet i musen19. Thus, förstå arbetar mekanismen av TGF-β-medierad immunsuppression kommer att leda till identifiering av ett tillgängligt terapeutiska mål för behandling av cancer.
För att klarlägga de molekylära händelserna som är nödvändiga för NK cell utveckling, etablerat Williams et al. ett in vitro -system för differentiering murina benmärgen hematopoetiska stamceller in i NK cells20. Detta system underlättar i hög grad mekanistiska studier av NK cell utveckling, inbegripet identifiering av romanen föräldraparets NK celler21. Men benmärgen föräldraparets bör vara odlade i systemet med stödja OP9 stromaceller som en feeder lager20,21, och denna heterogena cell befolkningen i stor utsträckning begränsar den fortsatta tillämpningen av gen-störa verktyg (t.ex., siRNA-medierad nedtystning) specifikt tillämpas på särskiljande NK-celler.
Här beskriver vi ett feeder-fria system som har utvecklats av ytterligare modifiera systemet in vitro- Williams et al20. I vårt system, OP9 stromal feeder cellerna behövs inte, och i stället OP9 villkorlig medium används utan att det påverkar differentieringen av NK celler in vitro-och detta nyligen leda oss att avslöja att TGF-β är kunna främja cancer progression via undertrycka E4bp4-beroende NK cell utveckling i tumör mikromiljö22. Detta nya system framgångsrikt ger en bakgrund-fri metod för att belysa den molekylära mekanismen av NK cell utveckling under särskilda förhållanden (t.ex.hög TGF-β1, siRNA-medierad nedtystning, etc.) in vitro.
I detta arbete, har vi beskrivit en ny metod för att producera benmärg-derived murina NK celler in vitro. Cell mataren i det ursprungliga systemet21,22 är framgångsrikt ersatt av villkorlig medlet av OP9 celler, vilket i hög grad ökat det differentiering systemet stabilitet. Dessutom systemet kan producera hög kvantitet och renhet av mogen NK celler för in vitro- liksom i vivo analyser, som kan underlätta den mekanistiska under…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av den forskning stipendier rådet Hongkong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) och Innovation och teknologi fond i Hongkong (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), bidrag för forskning-CUHK (2016.035) och Hong Kong Scholar Programmet.
H.-yl utformade och övervakade alla experiment och bidragit till manuskriptet förberedelse. P.M.-K.T. utförde experiment, analyserat data och bidragit till manuskriptet förberedelse. P.C.-T. T., J.Y.-FC, J.S.-C., H., f.-M.W., och G.-yl samlade djur prover och deltog i djurförsök. J.S., X.-R.H., och K.-F.T. bidragit till manuskriptet förberedelse.
OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |