Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento
Summary
En este protocolo, se describe una técnica para descubrir Zika virus diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Este protocolo readly puede ser adaptado para otras enfermedades infecciosas emergentes.
Abstract
Microarrays de alta densidad péptido permite detección de péptidos de más de 6 mil sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Este método puede ser aplicado para el descubrimiento de medicamentos, identificación de objetivos terapéuticos y el desarrollo del diagnóstico. Aquí, presentamos un protocolo para descubrir Zika virus (ZIKV) diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Una muestra de suero humano validada para infección por ZIKV fue incubada con una microarrays de alta densidad péptido que contiene la proteína ZIKV toda traducida en 3.423 única 15 lineal de aminoácidos (aa) los residuos con una superposición de residuos 14-aa impreso por duplicado. Coloración con los anticuerpos secundarios diferentes dentro de la misma matriz, detectamos péptidos que se unen a la inmunoglobulina M (IgM) y anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) en suero. Estos péptidos fueron seleccionados para experimentos de validación adicionales. En este protocolo, se describe la estrategia para diseñar, procesar y analizar un microarray de péptidos de alta densidad.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnosis basada en los síntomas clínicos es desafiadora porque comparte vectores, distribución geográfica y los síntomas con Dengue y Chikungunya virus infección1. Dado el riesgo de resultados adversos del embarazo en las mujeres infectadas con ZIKV durante el embarazo, es importante distinguir entre los 3 virus. Aunque las pruebas de diagnóstico moleculares actuales son específicas, son sólo útiles en sangre o saliva durante el relativamente corto período de infección aguda2,3. Análisis serológicos son esenciales para el diagnóstico fuera de este período inicial de la infección4.
El desarrollo de un ensayo serológico específico ZIKV es difícil por dos razones: en primer lugar, los Zika antígenos que el sistema inmunológico humano responde a actualmente no se conocen; y secuencias de aminoácidos de flaviviruses segundo, conservado inducen reactividad cruzada del anticuerpo. Nuestro objetivo era descubrir el únicos péptidos específicos ZIKV a utilizarse en el diagnóstico. Se han desarrollado diferentes enfoques a las bibliotecas de péptidos pantalla cubriendo todas proteínas incluyendo fagos bacterianos, y mostrar la superficie de la levadura5,6,7,8,9, 10. Nuestra estrategia era utilizar un microarray de péptidos de alta densidad que permite la rápida y de bajo costo alto rendimiento exámenes serológicos11,12 y posteriormente los péptidos identificados se pueden utilizar para mejorar la corriente serológica ensayos para la detección de infección por ZIKV.
Este protocolo permite el descubrimiento de Zika virus diagnóstico péptidos específicos con un microarray de péptidos de alta densidad (figura 1). Los microarrays de alta densidad péptido fue producido usando la tecnología de impresión de láser de péptido. La secuencia de proteína entera ZIKV consisten en residuos de aminoácidos 3.423 basado en la cepa Polinesia francesa (GenBank: KJ776791.2), fue impreso en un portaobjetos de vidrio estándar en bloques de 15 residuos lineales con una superposición de 14 residuos de aminoácidos por duplicado para un total de 6.846 puntos del péptido. Además de los péptidos de secuencia de la proteína de Zika todos el microarray utiliza hemaglutinina de Influenza (HA) péptidos para controles internos.
Una Zika validado positivo muestra de suero obtenida del centro de Wadsworth (Albany, NY), se utilizó para identificar péptidos reactivas la inmunoglobulina G (IgG) y específicos de la inmunoglobulina M (IgM). Después de la incubación con la muestra durante la noche, el microarray fue teñido con un anticuerpo conjugado del fluorocromo secundario (anti-human IgM o anti-IgG humanas) y analizado en un escáner de microarreglos. Cuantificación de intensidades spot y péptido anotación fue realizada con un software específico suministrado por la misma compañía que fabricó el microarray.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos diseñado un protocolo de utilización de un microarray de alta densidad péptido que contiene la secuencia de proteína de virus Zika entera (cepa Polinesia francesa). El microarray fue fabricado por péptidos lineales superpuestas diferentes 3.423 impresión. Cada péptido fue 15 aminoácidos y variados por un único residuo de su vecino más cercano en la secuencia (es decir, superposición de residuos 14). Aunque se superpone más corto puede ser impreso, Mapeo epitopo es más preciso con traslapos má…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Es actual apoyado por una subvención de suplemento administrativo SBIR (Small Business Innovation Research) de NIDCRR44 DE024456. Subvención NIDCR VIH que evolucionó de subvención NIDCR U01 DE017855 para el desarrollo de un diagnóstico confirmatorio de punto de atención para el VIH. Agradecemos a Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) su asistencia técnica y apoyo. También agradecemos a NYU Langone Medical Center por el LI-COR odisea sistema de imágenes.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
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