Un'analisi semplice e a basso costo per la misurazione della deambulazione in modelli murini di distrofia muscolare
Summary
Questo protocollo descrive un sistema flessibile, a basso costo per la misurazione della deambulazione del mouse in un’analisi di attività di campo aperto. Vi mostriamo un saggio di deambulazione di 6 minuti basato su questo sistema rileva una diminuzione nel movimento volontario nei topi mdx che distingue accuratamente miglioramento in un salvataggio di muscolo-specific di questi animali.
Abstract
Misurazione dei risultati funzionali nel trattamento della distrofia muscolare è un aspetto essenziale del test preclinici. La valutazione della deambulazione volontaria in modelli murini è un saggio di attività non-invasivo e riproducibile che è direttamente analoga alle misure del paziente deambulazione come il 6-minute walk test e relativi punteggi di mobilità. Molti metodi comuni per il test di velocità di deambulazione del mouse e distanza sono basati sul test di campo aperto, dove la libera circolazione di un animale all’interno di un’arena è misurata nel tempo. Uno svantaggio principale di questo approccio è che il software commerciale e attrezzature per il tracciamento del movimento ad alta risoluzione sono costosa e possono richiedere il trasferimento di topi a strutture specializzate per il test. Qui, descriviamo un sistema a basso costo, basati su video per la misurazione della deambulazione del mouse che utilizza il software libero e open-source. Usando questo protocollo, dimostriamo che volontaria della deambulazione nel modello del topo del dystrophin-null mdx per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è diminuita rispetto al mouse di selvaggio-tipo attività. In mdx topi che esprimono il transgene di utrofina, questi deficit di attività non vengono osservati e la distanza totale percorsa è indistinguibile da topi wild-type. Questo metodo è efficace per misurare i cambiamenti nel ambulation volontario associato a patologia distrofica e fornisce una piattaforma versatile che può essere facilmente adattata alle impostazioni di ricerca diversi.
Introduction
Misurazioni affidabili e riproducibili di funzione muscolare sono fondamentali per valutare l’efficacia delle terapie potenziali per la DMD. DMD è una malattia genetica causata da mutazioni nel gene della distrofina, che conduce alla debolezza muscolare progressiva, perdita della deambulazione ed eventuale insufficienza cardiorespiratoria. Il modello animale più ampiamente usato di DMD è il mouse dystrophin-null mdx . Una batteria di test funzionali sono emersi come analisi di routine per valutare la progressione di malattia nel topo mdx così come in modelli animali simili di altre distrofie e miopatie. Comunemente usato in vivo analisi includono misurazioni della forza di presa della zampa anteriore, filo appeso tempo, massimo rotarod, ora ad esaurimento durante il rilevamento delle attività in esecuzione e motore tapis roulant. C’è stato un notevole sforzo nel campo per standardizzare questi test, con l’obiettivo di riduzione della variabilità tra gli studi preclinici e aumentando il potenziale traslazionale di terapeutica testato in topi1,2.
Una categoria importante di test preclinici è la misura del movimento volontario, un parametro che è frequentemente alterato in modelli murini di distrofia muscolare. Questo solitamente è testato da saggi basati su campo aperto attività di monitoraggio e può valutare orizzontale (a piedi) o movimenti verticali (allevamento) sopra un corso di minuti o ore2,3,4. Una serie di studi hanno dimostrato il movimento volontario per essere alterata in topi mdx , particolarmente dopo l’esercizio, e queste misurazioni hanno dimostrate di essere sensibili alla progressione di malattia e trattamento di droga. Uno dei principali limiti nell’esecuzione di queste analisi è la necessità di apparecchiature specializzate, ad alto costo. Qui, viene presentato un metodo di basso costo che tiene traccia della deambulazione del mouse utilizzando risorse prontamente disponibili.
La distanza di 6 minuti a piedi è una metrica comunemente usata come uno strumento di valutazione clinica in individui con la distrofia muscolare di Duchenne5,6. Le modifiche di questa misura sono state usate per valutare i risultati in modelli animali di Duchenne, compresi di topi mdx 7 e documentalista dorato distrofia muscolare (GRMD) cani8. In questo studio, registriamo il movimento volontario campo aperto in 6 minuti subito dopo una sfida di esercizio mite. Distanza di deambulazione è stata quindi calcolata utilizzando software open-source gratuito per misurare il movimento orizzontale nel corso del tempo.
Il vantaggio principale di questo metodo è che gli animali possono essere testati in una varietà di impostazioni senza bisogno di attrezzature specializzate o software commerciale ad alto costo per l’analisi. Un aspetto importante di questa analisi è che può essere eseguita in un ambiente di laboratorio di base senza la necessità di spostare o trasferire i topi fuori il vivarium in una struttura specializzata. Il protocollo di rilevamento video descritto qui è particolarmente adatto per la valutazione della deambulazione relativamente a periodi di tempo breve e può rilevare differenze di attività tra topi wild-type e mdx , nonché miglioramento funzionale in un salvataggio di rivelare modello di DMD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il dosaggio di campo aperto consente di testare la funzione motoria in modelli murini di malattia del muscolo in modo efficace e non invasivo, e variazioni di questo test possono servire come una misura di endpoint prezioso per studi pre-clinici. Uno dei principali limiti con questo tipo di analisi è l’accessibilità ad alto costo e limitato di sistemi di monitoraggio delle attività. In questo studio, dimostriamo un sistema a basso costo per l’analisi di attività di campo aperto che possono generare risultati simili a…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health [AR048179 R01 e R01 HL126204 R.C.W, AR059033 T32 e F32 AR069469to E.M.G] e la distrofia muscolare Association USA [274143 e 416364 di RCW].
Materials
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
Referencias
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker’s guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
