En enkel og billig analyse til måling af Ambulation i musemodeller af Muskelsvindfonden
Summary
Denne protokol beskriver en fleksibel, billig system til måling af musen ambulation i en åben mark aktivitet assay. Vi viser, at en 6-minutters ambulation analysen baseret på dette system registrerer et fald i frivillig bevægelse i mdx mus og præcist adskiller forbedring i en muskel-specifikke redning af disse dyr.
Abstract
Måling af funktionelle resultater i behandlingen af muskelsvind er et vigtigt aspekt af prækliniske forsøg. Vurdering af frivillige ambulation i musemodeller er en non-invasiv og reproducerbare aktivitet assay, der direkte svarer til foranstaltninger i patient ambulation såsom 6-minutters gang test og relaterede mobilitet scores. Mange fælles metoder til afprøvning af mus ambulation hastighed og afstand er baseret på open field test, hvor et dyr frie bevægelighed inden for en arena er målt over tid. En stor ulempe ved denne tilgang er at kommercielle software og udstyr til høj opløsning bevægelsessporing er dyre og kan kræve overførsel mus til specialiserede faciliteter til test. Her, beskriver vi en lavpris-, video-baseret system til at måle mus ambulation, der udnytter gratis og open-source software. Ved hjælp af denne protokol, vise vi at frivillige ambulation i dystrofin-null mdx musemodel for Duchennes muskeldystrofi (DMD) er faldet i forhold til wild-type mus aktivitet. I mdx mus at udtrykke utrophin transgen, disse aktivitet underskud overholdes ikke, og den samlede afstand rejste er umulig at skelne fra wild-type mus. Denne metode er effektiv til at måle ændringer i frivillig ambulation tilknyttet dystrofe patologi, og giver en alsidig platform, som let kan tilpasses til forskellige forskningsfora.
Introduction
Pålidelig og reproducerbar måling af muskelfunktion er kritisk for at vurdere effekten af potentielle terapier for DMD. DMD er en genetisk sygdom forårsaget af mutationer i dystrophin genet, fører til progressiv muskelsvaghed, tab af ambulation og eventuel kardiorespiratorisk svigt. Den mest udbredte dyremodel af DMD er dystrofin-null mdx musen. Et batteri af funktionelle tests er dukket op som rutine assays til evaluering af sygdomsprogression i mdx musen så godt som i lignende dyremodeller for andre dystrophies og myopatier. Almindeligt anvendte i vivo assays omfatter målinger af forelimb gribestyrke, wire hængende tid, rotarod maksimum, tid til udmattelse under løbebånd kører, og motoriske aktivitet sporing. Der har været en væsentlig indsats i feltet for at standardisere disse prøver, med mål at reducere variabiliteten mellem prækliniske undersøgelser og øge translationel potentialet i therapeutics testet i mus1,2.
En vigtig kategori af prækliniske forsøg er måling af frivillig bevægelse, en parameter, der ofte ændres i murine modeller af muskelsvind. Dette er normalt testet af assays baseret på åben mark Aktivitetsovervågning, og kan evaluere enten vandret (til fods) eller lodret (opdræt) bevægelser i løbet af minutter eller timer2,3,4. En række undersøgelser har vist frivillig bevægelse ændres i mdx mus, især efter træning, og disse målinger har vist sig at være følsomme over for narkotika behandling og sygdom progression. En stor begrænsning i udførelsen af disse assays er behov for specialiseret, høje omkostninger udstyr. Her, præsenteres en billig metode, der sporer mus ambulation ved hjælp af let tilgængelige ressourcer.
6 minutters gang afstand er en metrikværdi, der almindeligvis anvendes som et værktøj til klinisk vurdering i personer med Duchennes muskeldystrofi5,6. Ændringer af denne foranstaltning har været anvendt til at vurdere resultater i dyremodeller af Duchenne, herunder mdx mus7 og golden retriever muskeldystrofi (GRMD) hunde8. I denne undersøgelse registrerer vi frivillige friland bevægelse i de 6 minutter umiddelbart efter en mild øvelse udfordring. Ambulation afstand blev derefter beregnet ved hjælp af gratis open source-software til at måle vandret bevægelse over tid.
Den største fordel ved denne metode er, at dyr kan blive testet i en række indstillinger uden behov for specialudstyr eller høje omkostninger kommerciel software til analyse. Et vigtigt aspekt af denne analyse er, at det kan udføres i en grundlæggende laboratorium indstilling uden at flytte eller overføre mus ud af vivarium til en specialiseret core facilitet. Video-tracking protokollen beskrevet her kan er velegnet til vurdering af ambulation over relativt kort tid-perioder og opdage aktivitet forskelle mellem wild-type og mdx mus, samt afsløre funktionelle forbedringer i en redning model af DMD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Friland-analysen giver en effektiv og ikke-invasiv måde at teste motorik i musemodeller for muskel sygdom, og variationer af denne analyse kan tjene som en værdifuld slutpunkt mål for prækliniske undersøgelser. En stor begrænsning med denne type af analysen er den høj pris og begrænset tilgængelighed af aktivitet overvågning systemer. I denne undersøgelse viser vi et billigt system til friland aktivitet analyse, der kan generere lignende resultater til eksisterende kommercielle software og udstyr. Dette system…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health [R01 AR048179 og R01 HL126204 til R.C.W, T32 AR059033 og F32 AR069469to E.M.G] og muskelsvind Association USA [274143 og 416364 til R.C.W.].
Materials
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
Referencias
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker’s guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
