In Vivo Überwachung der circadianen Uhr Genexpression in der Maus Suprachiasmatischen Kern mit Fluoreszenz-Reporter
Summary
Diese neu entwickelte Fluoreszenz basierende Technologie ermöglicht Langzeit-monitoring der Transkription der circadianen uhrengene im Suprachiasmatic Nucleus (SCN) Mäuse in Echtzeit und mit einer hohen zeitlichen Auflösung frei zu bewegen.
Abstract
Diese Technik verbindet optische Faser vermittelt Fluoreszenz Aufnahmen mit der präzise Lieferung von recombinant Adeno-assoziierten Virus basierte gen Reporter. Dieses neue und einfach zu bedienen in Vivo Fluoreszenz monitoring-System wurde entwickelt, um die transkriptionelle Rhythmus des Gens Uhr Cry1, im suprachiasmatischen Kern (SCN) frei beweglichen Mäuse aufzeichnen. Hierzu wurde ein Cry1 Transkription Fluoreszenz Reporter entworfen und verpackt in Adeno-assoziierten Virus. Gereinigtes, konzentrierter Virus injiziert wurde, in die Maus SCN, gefolgt durch die Einfügung einer Glasfaser, die dann auf die Oberfläche des Gehirns behoben wurde. Die Tiere waren kehrte in ihre Heimat Käfige und erlaubt eine 1 Monat postoperativen Erholungsphase ausreichend Reporter Ausdruck sicherzustellen. Fluoreszenz verzeichnete dann frei beweglichen Mäuse über einen in-Vivo monitoring-System, das in unserer Einrichtung erstellt wurde. Für die in Vivo recording-System wurde 488 nm Laser mit einem Strahlteiler 1 × 4 gekoppelt, die das Licht in vier Erregung Laserleistungen gleicher Leistung unterteilt. Diese Einrichtung konnten wir aus vier Tiere gleichzeitig aufnehmen. Jedes der emittierte Fluoreszenz Signale wurde über einen Photomultiplier Röhre und einer Datenkarte Erwerb gesammelt. Im Gegensatz dazu erlaubt, die früheren Biolumineszenz in Vivo circadianen Uhr Aufnahmetechnik, diese Fluoreszenz in Vivo recording-System die Aufzeichnung der circadianen Uhr gen-Expression in den Licht-Zyklus.
Introduction
Bei Säugetieren regelt der suprachiasmatischen Kern (SCN) den ganzen Körper zirkadianen Rhythmus um eine individuelle Reaktion auf exogene Veränderungen der Umwelt (z.B., Licht, Temperatur, Druck usw.)1zu koordinieren. Uhr Kernkomponenten bestehen aus Per1-3, Cry1-2, Uhrund Bmal1und spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der circadianen Uhr jeder Zelle. Jede Zelle in der SCN enthält den transcriptional Aktivator, CLOCK/BMAL1, fungiert als ein Heterodimer induzieren die Expression von v. und Weinen. Das KGV / Schrei-Komplex hemmt dann die Funktion der Uhr/BMAL1, eine Transkription-Übersetzung-Feedback-Schleife zu bilden, das dauert etwa 24 h komplett2,3.
Frühere Studien über die SCN haben vor allem die ex Vivo SCN Stück Kultur Methode4,5,6 eingesetzt und während dieser Ansatz wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt hat, haben seine Grenzen unserer Fähigkeit, gehemmt Daten über den Einfluss der anderen Gehirn-Kerne auf der SCN sowie die Wirkung von exogenen Reize (z.B.Licht) auf Zellen, die ihren Wohnsitz in diesem kritischen Bereich zu erhalten. Im Jahr 2001 erstmals Hitoshi Okamuras Gruppe der Biolumineszenz-System zur in-Vivo Genexpression Monitor circadianen Uhr im SCN in frei beweglichen Mäuse7verwenden. Ken-Ichi Honma Gruppe verbrachte die letzten Jahren Weiterentwicklung der Biolumineszenz in Vivo recording-System in der SCN8,9,10. Zusammen haben diese Studien Forscher mit der Fähigkeit der circadiane Uhr in ständiger Dunkelheit oder nach einem Lichtimpuls zu überwachen zur Verfügung gestellt. Jedoch da Biolumineszenz zu schwach ist für kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus, gepaart mit der Tatsache, dass Licht das vorherrschende Signal für die SCN-vermittelten Entrainment ZIRKADIANE Uhren11erforderlich ist es gibt steigende Nachfrage für die Entwicklung von experimentellen Methoden, die Überwindung der Grenzen Biolumineszenz Aufnahme zugeordnet. Der vorliegende Bericht beschreibt ein Fluoreszenz-basiertes System, das errichtet wurde, um die innere Uhr des SCN in Vivo in Mäusen frei beweglich zu überwachen. Diese einfach zu bedienende Methode ermöglicht kontinuierliche Überwachung während des Hell-Dunkel-Zyklus und ermöglicht die langfristige Beobachtung der Transkription von Genen der circadianen Uhr im SCN in Echtzeit und in hoher zeitlicher Auflösung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Im Gegensatz zu ex-Vivo -Methoden, z. B. Slice Kultur4,5, RT-PCR16und in Situ Hybridisierung17, die erfordern, dass Tiere getötet werden, kann das in Vivo Aufnahme Methode Ermittler, circadiane Genexpression in ein lebendes Tier zu studieren. Als solche bietet diese Technologie die Möglichkeit, die Wirkung der verschiedenen körperlichen Störungen (z.B., Schlafentzug, Stress, E…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mitglieder im Zhang Labor für anregende Diskussionen und Mitglieder im Zhan Labor für technische Hilfestellung bietet. Diese Forschung wurde durch 31500860 (zu C.Z) Zuschüsse der NSFC, 2012CB837700 (zu E.E.Z. und C.Z) des Programms 973 aus der M.O.S.T. von China, und durch die Finanzierung von kommunalen Regierung in Peking unterstützt. E.E.Z. wurde von den Chinesen “Recruitment Programm von Global Youth Experts” unterstützt.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
Referencias
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