Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu
Summary
Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.
Abstract
Candida albicans hastane edinilen sepsis vakaların yaklaşık % 15’i neden insanlar, en sık görülen mantar patojen var. Bir büyük virülans C. albicans özniteliktir onun yetenek-e doğru formu biyofilmler, biyotik ve abiyotik yüzeylere bağlı hücre yapılandırılmış topluluklar. C. albicans biyofilmler Mukozal katmanlar gibi ana bilgisayar doku ve tıbbi cihazlar, Kateterler, Kalp pilleri, protez ve eklem protezleri gibi oluşabilir. Fiziksel ve kimyasal tedirginlikler için son derece dayanıklıdır ve tohum için rezervuarlar enfeksiyonlar Dissemine hareket edebilir çünkü biyofilmler önemli klinik sorunlar teşkil. Çeşitli vitro deneyleri C. albicans biyofilm oluşumu, microtiter plaka deneyleri, Kuru Ağırlık ölçüleri, hücre canlılığı deneyleri ve confocal tarama lazer mikroskobu gibi eğitim için kullanılmıştır. Tüm bu deneyleri tek son nokta deneyleri, nerede biyofilm oluşumu belirli bir zaman noktasında değerlendirilir vardır. Burada, biz gerçek zamanlı laminar akış koşullar altında bir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanarak biyofilm oluşumu çalışma için bir protokol tanımlamak. Biyofilm zaman içinde bu ana bilgisayarın bu vasküler kateter karşılaştı gibi taklit özelleştirilebilir koşul kullanma geliştikçe bu yöntem biyofilm oluşumu gözlem için sağlar. Bu iletişim kuralı genetik mutantlar biyofilm kusurlarý yanı sıra biyofilm geliştirme gerçek zamanlı olarak antimikrobiyal ajanlar inhibitör etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Ancak bu aynı zamanda bir fırsatçı patojen, yüzeysel ve ciddi mantar enfeksiyonları1,2neden yeteneğine candida albicans insan microbiota komensal bir üyesidir. Bir büyük virülans özellik C. albicans , onun yetenek forma esnek ve ilaca dirençli biyofilmler, hücre toplulukları bir yüzeye yapıştırılır ve bir hücre dışı matriks malzeme1,3‘ te alınmış. C. albicans biyofilmler son derece yapısal, birden çok hücre tiplerinin birkaç kat içeren (tomurcuklanma Maya biçimli yuvarlak hücreler, oval pseudohyphal hücreleri ve tübüler hyphal hücreleri)4. C. albicans biyofilm geliştirme yüzeyde bu hücrelerin çoğalması tarafından takip bir yüzey (biyofilm tohum), yuvarlak mantar biçimli hücrelerin bağlılık ile başlar ve sonra olgunlaşmamış biyofilm olgunlaşma yapısı içine bir hücre dışı matriks malzeme4tarafından çevrili tam olarak kurulan biyofilm. Olgun biyofilm ağırlıklı olarak biyofilm4mimari istikrar sağlayarak yoğun ve bağlantılı ağlar oluşturmak uzun hyphal hücreleri oluşur. Biyofilm yaşam döngüsü boyunca mayası yuvarlak hücreler olgun biyofilm dağıtmak ve Dissemine enfeksiyonlara neden veya diğer siteler4,5yeni biyofilmler tohum vücudun diğer bölgelerine seyahat olabilir. C. albicans biyofilmler biyotik yüzeylerde, Mukozal yüzeyler gibi ve ana bilgisayar doku, boyunca ve Kateterler, Kalp pilleri, takma diş ve protez eklemler gibi abiyotik yüzeylerde oluşabilir. Biyofilmler inatçı özelliklerini, nedeniyle ortadan kaldırmak son derece zordur ve çoğu zaman tek etkili tedavi stratejisi enfekte cihaz4çıkartılmasıdır. Böylece biyofilm oluşumu gözlenen klinik ayarlarında benzer koşullarda araştırmak önemlidir.
C. albicans biyofilm oluşumu6,7,8eğitim için kullanılan çeşitli kritik in vivo hayvan modelleri vardır; Ancak, bu çalışmalar ve pahalı, zaman alıcı olabilir suşları ve belirli bir zamanda test edilebilir antimikrobiyal ajanlar sayısıyla sınırlıdır. Vitro biyofilm deneyleri, öte yandan, antifungal bileşikler ve mutant suşları hızlı, yüksek üretilen iş değerlendirmesi için izin ve çok daha düşük maliyetli ve taşınan biyofilm deneyleri daha etik hayvan out modelleri9, 10,11,12,13,14. Burada geliştirilen ve biyofilm oluşumu laminar akış özelleştirilebilir mikrosıvısal aygıt14,15kullanarak geçici altında gözlemlemek için en iyi duruma getirilmiş bir vitro tahlil açıklayın. Tahlil her aşamasında ilk bağlılık adım, hücre çoğalması, biyofilm olgunlaşma ve hücre dağılımı gibi biyofilm oluşumu görselleştirme için sağlar. Tahlil de hücre morfolojisi değişiklikleri bir biyofilm gelişimi boyunca görselleştirmek yararlıdır.
Genellikle yüksek üretilen iş, süre vitro biyofilm deneyleri için kullanılmaktadır Microtiter levha, kontrollü akış koşulları için izin vermez. Geleneksel laminar akım hücre sistemleri biyofilm oluşumu kontrollü akış koşullarında sürekli değerlendirilmesi için izin, ancak bunlar çoğu kez kurmak ve dinamik aralık denetimi ve işlem hacmi sınırlıdır eğilimindedir için zaman alıcı. Burada kullanılan mikrosıvısal cihaz bu sınırlamalar (48 wells içeren) yüksek işlem hacmi plakaları birleştirerek yerleşik laminar akış odası ile üstesinden gelir ve son derece çok yönlü, tekrarlanabilir ve özelleştirilebilir.
Burada, bir vahşi-türü C. albicans biyofilm oluşumu değerlendirmek için piyasada bulunan otomatik mikrosıvısal cihazın kullanımı için bir protokol tarif zorlanma, bilinen bir antifungal ajan bir biyofilm ve biyofilm gelişimi üzerine etkisi daha önce biyofilm için rapor edilmiştir (bcr1Δ/Δ ve efg1 Δ/Δ) iki mutant suşları oluşumunda vitro ve in vivo16,17,18kusurları. Açıklanan Protokolü biyofilm oluşumu bir biyofilm gelişimi boyunca inhibe antimikrobiyal ajanların etkinliğini test etmek ve mutant kitaplıkları eleme tarafından normal biyofilm gelişimi için gerekli genler tanımlamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan özelleştirilebilir mikrosıvısal biyofilm tahlil biyofilm oluşumu görselleştirme sağlar gerçek zamanlı bir sabit oranlı laminar akış ve sabit sıcaklık maruz bir tek hücre düzeyinde. Vahşi-türü ve mutant suşları biyofilmler gelişimi çalışma için güçlü bir araç sağlar ve klinik ayarlarında antimikrobiyal Ajan tedavilerinin biyofilmler fizyolojik koşulları taklit koşullar altında üzerinde etkileri görülmektedir. Çoğu vitro biyofilm deneyleri, gerçek zaman…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biyofilm deneyleri üzerinde tüm üyeleri için yararlı tartışmalar Nobile laboratuarı, teşekkür ederim. Bu çalışmada Sağlık (NIH) hibe R21 AI125801 (C.J.N.) ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. DLR Üniversitesi California Meksika ve Amerika Birleşik Devletleri (UC-MEXUS) ve Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) Enstitüsü’nden Doktora Bursu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Referencias
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
