JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Traducción Automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Inmunología y contagio

Intraperitoneal glukostoleranstest, mätning av lungfunktionen och fixering av lungan att studera effekterna av fetma och nedsatt Metabolism på pulmonell utfall

Published: March 15, 2018
doi:
10.3791/56685
, , , , , , ,
1Translational Experimental Pediatrics, Experimental Pulmonology, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine,University of Cologne, 2Department of Pediatrics and Adolescent Medicine,University of Cologne, 3Division of Experimental Pediatrics and Metabolism, University Children’s Hospital,Heinrich Heine University Düsseldorf

Summary

Förekomsten av fetma ökar och ökar risken för kroniska lungsjukdomar. För att fastställa bakomliggande mekanismer och förebyggande strategier, väldefinierade djur modeller behövs. Här, tillhandahåller vi tre metoder (glukos-tolerans-test kropp pletysmografi och lung fixering) att studera effekten av fetma på pulmonell utfall hos möss.

Abstract

Fetma och andningsbesvär är stora hälsoproblem. Fetma blir en framväxande epidemi med ett förväntat antal över 1 miljard överviktiga individer i världen 2030, som alltså representerar en växande socioekonomisk börda. Samtidigt, är andra fetmarelaterade sjukdomar, inklusive diabetes samt hjärta och kroniska lungsjukdomar, kontinuerligt på uppgång. Trots att fetma har associerats med ökad risk för astmaexacerbationer, är försämring av luftvägssymptom och dålig kontroll, den funktionella rollen för fetma och perturbed metabolism i patogenesen av kronisk lungsjukdom ofta underskattat, och molekylära mekanismer bakom förbli svårfångade. Denna artikel syftar till att presentera metoder för att bedöma effekten av fetma på ämnesomsättning, samt lung struktur och funktion. Här, vi beskriver tre tekniker för möss studier: (1) bedömning av intraperitoneal glukostolerans (ipGTT) att analysera effekten av fetma på glukosmetabolismen; (2) mätning av luftvägsmotståndet (Res) och andningsorganen efterlevnaden (Cdyn) för att analysera effekten av fetma på lungfunktionen; och (3) förberedelse och fixering av lungan för efterföljande kvantitativa histologisk utvärdering. Fetmarelaterade lungsjukdomar är troligen multifaktoriell, som härrör från systemiska inflammatoriska och metabola dysreglering som potentiellt negativt påverkar lungfunktionen och svar på behandling. En standardiserad metod att studera molekylära mekanismer och effekten av nya behandlingar är därför viktig.

Introduction

Enligt den Världshälsoorganisationen (WHO) i 2008, var mer än 1,4 miljarder vuxna, över 20 år, överviktiga med ett body mass index (BMI) större än eller lika med 25. vidare över 200 miljoner män och nästan 300 miljoner kvinnor var överviktiga (BMI≥30)1. Fetma och metabolt syndrom är stora riskfaktorer för en mängd sjukdomar. Samtidigt fetma och samtidig ökad vit fettvävnad massa har varit intimt knuten för att typ 2 diabetes2,3, hjärt-kärlsjukdomar inklusive kranskärlssjukdom (CHD), hjärtsvikt (HF), förmaksflimmer4 och artros5, förblir deras funktionella roller i patogenesen av andningsbesvär dåligt förstådd. Epidemiologiska studier har dock visat att fetma är starkt förknippad med kronisk respiratorisk villkor, inklusive ansträngningsutlöst dyspné, obstruktiv sömnapné syndrom (OSAS), obesitas hypoventilationssyndrom (OHS), kronisk obstruktiv lungsjukdom (kol), lungemboli, aspirationspneumoni och bronkial astma6,7,8,9. Potentiella mekanismer länka fetma och perturbed metabolism, t.ex., insulinresistens och diabetes typ II, till patogenesen av kronisk lungsjukdom inte bara omfattar mekaniska och fysiska konsekvenser av vikt vinst på ventilation men också inducera en kronisk subakuta inflammatoriska tillståndet10,11. Ökningen av fetma och lungsjukdomar under det senaste decenniet, tillsammans med bristen på effektiva strategier för förebyggande och terapeutiska metoder, belyser behovet av att undersöka de molekylära mekanismerna för att definiera nya vägar för att hantera fetma lung sjukdomar.

Här, vi beskriver tre standard tester, som är de viktigaste grunderna att undersöka fetma och dess inverkan på lung struktur och funktion i musmodeller: (1) intraperitoneal glukos tolerans (ipGTT) (2) mätning av luftvägsmotståndet (Res) och respiratorisk systemet efterlevnad (Cdyn); och (3) förberedelse och fixering av lungan för efterföljande kvantitativa histologisk utvärdering. IpGTT är en robust screeningtest till åtgärd glukosupptag, och därmed effekten av fetma på ämnesomsättningen. Enkelheten i metoden tillåter bra standardisering och därför jämförbarheten av resultat mellan laboratorier. Mer sofistikerade metoder, såsom hyperglykemiska klämmor eller studier på isolerade öar, kan användas för detaljerad analys av de metabola fenotyp12. Här bedömer vi glukostolerans för att definiera en fetma-associerade tillstånd av systemisk och metabola störning som grund för fortsatta studier på en pulmonell resultatet. För att bedöma effekten av fetma och ämnesomsättningssjukdom på lungfunktion, mätte vi luftvägsmotståndet (Res) och andningsorganen efterlevnaden (Cdyn). För att karakterisera lungsjukdom, finns ohämmat samt återhållen metoder för bedömning av lungfunktion. Ohämmad pletysmografi i fritt rörliga djur härmar ett naturligt tillstånd, vilket återspeglar andningsmönster; invasiva metoder, såsom Ingångsimpedans mätning av Res och cDyn i djupt sövda möss att bedöma dynamisk lung mekanik, är det däremot mer exakt13. Eftersom kroniska luftvägsbesvär reflekteras av histologiska förändringar av lungvävnaden, är rätt lung fixering för vidare analys överhängande. Valet av metoden vävnad fixering och förberedelser beror på fack i lungan som ska studeras, till exempel genomföra luftvägarna eller lungorna parenkymet14. Här beskriver vi en metod som möjliggör kvalitativ och kvantitativ bedömning av ledande luftvägarna att studera effekten av fetma på astma utveckling.

Protocol

Alla djur förfaranden genomfördes i enlighet med protokoll som godkänts av lokala myndigheter (mark NRW, AZ: 2012.A424), och var enligt den tyska djurskydd lag och bestämmelserna om välbefinnande av djur som används för experiment eller för andra vetenskapliga ändamål. Eftersom lung funktionen analys kan påverka lung struktur och därför efterföljande histologiska analyserar, bör mätning av Res och Cdyn och förberedelser och fixering av lungan för histomorphometry utföras i olika djur. Det går dock mä…

Representative Results

Representativa resultat av intraperitoneal glukostoleranstest (ipGTT) (figur 4), lung funktion test (figur 5), och representativa bilder som illustrerar hematoxylin och eosin målat lungorna (figur 6). IpGTT utfördes i feta möss (blå) efter 7 veckors hög-fett-kost (HFD). Vanliga kost-matade möss fungerade som kontroller (svart). Feta m…

Discussion

Denna rapport ger tre protokoll för tre olika metoder för att analysera effekterna av fetma på glukosmetabolismen och pulmonell utfall. Först glukostoleranstest ger möjlighet att analysera intracellulära glukosupptag och kan vara vägledande för insulinresistens. För det andra, hela kroppen pletysmografi är en teknik att mäta lungfunktion och är därmed bra att testa effekten av nya behandlingar. För det tredje, ett standardiserat fixering protokoll är viktigt för kvantitativa morfometriska analys för att …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Experimenten var stöds av Marga och Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Tyskland; Projektet 210-02-16 (MAAA), projektet 210-03-15 (MAAA) och av den tyska forskningsfondens (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Tyskland; Centrum för molekylär medicin Köln (CMMC; Universitetssjukhuset Cologne; Karriär befordranprogram; MAAA), Köln Fortune (fakulteten, universitetet i Köln; KD).

Materials

GlucoMen LX A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 38969 blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 39765 Test stripes
Glucose 20% B. Braun, Melsung, Germany 2356746
FinePointe Software DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-001
FPRC Controller DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1075-001
FPRC Aerosol Block DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-2306-001
Forceps FST, British Columbia, Canada 11065-07
Blunt scissors FST, British Columbia, Canada 14105-12
Micro scissors FST, British Columbia, Canada 15000-00
Perma-Hand 4-0 Ethicon, Puerto Rico, USA 736H Surgical suture
Roti-Histofix 4% Roth P087.1 4% Paraformaldehyd
Ketaset Zoetis, Berlin, Germany 10013389 Ketamine
Rompun 2% Bayer, Leverkusen, Germany 770081 Xylazine
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
  2. Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes?. International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
  3. Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
  4. Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
  5. Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
  6. Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
  7. Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
  8. Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
  9. Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
  12. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
  13. Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
  14. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
  15. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, (2008).
  16. Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
  17. Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
  18. Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
  19. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
  20. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
  21. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
  22. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, (2007).
  23. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
  24. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  25. Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
  26. Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
  27. Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
  28. Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
  29. Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
  30. Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance!. Eur Respir J. 30, 805 (2007).
  31. Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
  32. Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
  33. Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
  34. Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
  35. Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d’anesthesie. 40, 122-126 (1993).
  36. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
  37. Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
  38. Rolls, G. . Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
  39. Winsor, L., Woods, A., Ellis, R. Tissue processing. Laboratory histopathology. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
  40. Pearse, A. . Histochemistry, theoretical and applied. , (1980).
  41. Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
  42. Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
  43. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
  44. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).

Tags

Keywords: Intraperitoneal Glucose Tolerance TestLung Function MeasurementLung FixationObesityImpaired MetabolismPulmonary OutcomesRespiratory ResearchMetabolic DisordersLung StructureLung FunctionChronic Lung DiseasesTherapeutic ApproachesCOPDAsthmaFasted Blood GlucoseGlucose InjectionLung Function AssessmentAnesthesiaAnimal Models
check_url/es/56685?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Dinger, K., Mohr, J., Vohlen, C., Hirani, D., Hucklenbruch-Rother, E., Ensenauer, R., Dötsch, J., Alejandre Alcazar, M. A. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. J. Vis. Exp. (133), e56685, doi:10.3791/56685 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image