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Inmunología y contagio

Teste de tolerância à glicose intraperitoneal, medição da função pulmonar e a fixação do pulmão para estudar o impacto da obesidade e metabolismo prejudicado em resultados pulmonares

Published: March 15, 2018
doi:
10.3791/56685
, , , , , , ,
1Translational Experimental Pediatrics, Experimental Pulmonology, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine,University of Cologne, 2Department of Pediatrics and Adolescent Medicine,University of Cologne, 3Division of Experimental Pediatrics and Metabolism, University Children’s Hospital,Heinrich Heine University Düsseldorf

Summary

A incidência da obesidade está aumentando e aumenta o risco de doenças pulmonares crônicas. Estabelecer os mecanismos subjacentes e estratégias preventivas, animal bem definido modelos são necessários. Aqui, nós fornecemos três métodos (teste de tolerância à glicose, pletismografia de corpo e fixação do pulmão) para estudar o efeito da obesidade sobre os resultados pulmonares em camundongos.

Abstract

Obesidade e distúrbios respiratórios são problemas de saúde. A obesidade está se tornando uma epidemia emergente com um número esperado de indivíduos obesos mais 1 bilhão em todo o mundo em 2030, representando assim um peso crescente socioeconômico. Simultaneamente, comorbidades relacionadas à obesidade, incluindo diabetes, bem como o coração e doenças pulmonares crônicas, estão continuamente a aumentar. Embora a obesidade tem sido associada com aumento do risco de exacerbações da asma, agravamento dos sintomas respiratórios e controle pobre, o papel funcional de obesidade e metabolismo perturbado na patogênese da doença de pulmão crônica é muitas vezes subestimado, e mecanismos moleculares subjacentes permanecem indescritíveis. Este artigo tem como objetivo apresentar métodos para avaliar o efeito da obesidade no metabolismo, bem como a estrutura do pulmão e função. Aqui, descrevemos três técnicas para estudos de ratos: (1) avaliação de tolerância de glicose intraperitoneal (ipGTT) para analisar o efeito da obesidade no metabolismo da glicose; (2) medição da resistência das vias aéreas (Res) e conformidade do sistema respiratório (Cdyn) para analisar o efeito da obesidade sobre a função pulmonar; e (3) preparação e fixação do pulmão para posterior avaliação histológica quantitativa. Doenças pulmonares relacionadas com a obesidade são provavelmente multifatoriais, decorrentes da sistêmica desregulação metabólica e inflamatória que potencialmente negativamente influenciam a função pulmonar e a resposta à terapia. Portanto, uma metodologia padronizada para estudar os mecanismos moleculares e o efeito de tratamentos romance é essencial.

Introduction

De acordo com a Saúde Organização Mundial (OMS) em 2008, mais de 1,4 bilhões de adultos, com idades entre 20 e mais velhos, estavam acima do peso com um índice de massa corporal (IMC) maior ou igual a 25; Além disso, mais 200 milhões de homens e mulheres de quase 300 milhões eram obesos (BMI≥30)1. Obesidade e síndrome metabólica são importantes fatores de risco para uma infinidade de doenças. Enquanto a obesidade e o concomitante desenvolvimento aumentado de tecido adiposo branco massa tem sido intimamente associada ao tipo 2 diabetes2,3, doenças cardio-vasculares, incluindo doença coronariana (DAC), insuficiência cardíaca (HF), fibrilação atrial4 e osteoartrite5, seus papéis funcionais na patogênese de doenças respiratórias permanecem mal compreendidos. No entanto, estudos epidemiológicos têm demonstrado que a obesidade está fortemente associada com doenças respiratórias crônicas, incluindo esforço dispneia, síndrome de apneia obstrutiva do sono (SAOS), obesidade hipoventilação síndrome (SST), crônica doença pulmonar obstrutiva (DPOC), embolia pulmonar, pneumonia por aspiração e asma brônquica6,7,8,9. Potenciais mecanismos de ligação entre obesidade e metabolismo perturbado, por exemplo, resistência à insulina e diabetes tipo II, para a patogênese da doença de pulmão crônica não só compreendem as consequências físicas e mecânicas de peso ganho na ventilação mas também induzi a um estado inflamatório subagudo crônica10,11. O aumento da obesidade e doenças do pulmão durante a última década, juntamente com a falta de estratégias preventivas eficazes e abordagens terapêuticas, destaca a necessidade de investigar os mecanismos moleculares para definir novas vias para gerenciar o pulmão obesidade doenças.

Aqui, descrevemos três testes padrão, que são princípios importantes para investigar a obesidade e o seu impacto na estrutura do pulmão e função em modelos do rato: glicose (1) intraperitoneal tolerância (ipGTT) (2) medição da resistência das vias aéreas (Res) e respiratória conformidade de sistema (Cdyn); e (3) preparação e fixação do pulmão para posterior avaliação histológica quantitativa. O ipGTT é um teste de rastreio robusto para a absorção de glicose medida e, portanto, o efeito da obesidade no metabolismo. A simplicidade do método permite boa padronização e, portanto, a comparabilidade dos resultados entre os laboratórios. Métodos mais sofisticados, tais como braçadeiras hiperglicêmicos ou estudos sobre ilhotas isoladas, podem ser usados para análise detalhada do fenótipo metabólico12. Aqui nós avaliar a tolerância à glicose para definir um estado de obesidade associada de desordem metabólica e sistêmica como base para estudos adicionais em um resultado pulmonar. Para avaliar o efeito da obesidade e doença metabólica na função pulmonar, medimos a resistência das vias aéreas (Res) e conformidade do sistema respiratório (Cdyn). Para caracterizar a doença pulmonar, desenfreados, bem como comedidos métodos para avaliação da função pulmonar estão disponíveis. Pletismografia desenfreada em movimentando-se livremente animais imita um estado natural, refletindo os padrões de respiração; em contraste, métodos invasivos, tais como a medição de impedância de entrada do Res e cDyn em ratos anestesiados profundamente para avaliar a mecânica pulmonar dinâmica, são mais precisos13. Desde que as condições respiratórias crônicas são refletidas por alterações histológicas do tecido pulmonar, fixação adequada do pulmão, para posterior análise é iminente. A escolha do método de preparação e fixação de tecidos varia de acordo com o compartimento do pulmão que será estudado, por exemplo, realização de vias aéreas ou de parênquima pulmonar14. Aqui, descrevemos um método que permite a avaliação qualitativa e quantitativa das vias aéreas conduzindo para estudar o efeito da obesidade sobre o desenvolvimento de asma.

Protocol

Todos os procedimentos de animais foram conduzidos em conformidade com os protocolos aprovados por autoridades do governo local (Land NRW, AZ: 2012.A424) e estavam em conformidade com a lei alemã de bem-estar animal e os regulamentos sobre o bem-estar dos animais utilizados para experiências ou para outros fins científicos. Desde que a análise de função pulmonar pode afetar a estrutura do pulmão e portanto subsequentes analisa histológica, a medição de Res Cdyn e a preparação e fixação do pulmão por Histom…

Representative Results

Resultados representativos de teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT) (Figura 4), produtos de imagens de teste (Figura 5) e representante de função pulmonar ilustrando a hematoxilina e eosina manchado pulmões (Figura 6). O ipGTT foi realizado em ratos obesos (azuis) depois de 7 semanas de alta–dieta rica em gordura (HFD)…

Discussion

Este relatório fornece três protocolos para três diferentes métodos analisar o impacto da obesidade no metabolismo da glicose e resultados pulmonares. Primeiro, o teste de tolerância à glicose oferece a oportunidade de analisar a absorção de glicose intracelular e pode ser indicativo de resistência à insulina. Em segundo lugar, pletismografia de corpo inteiro é uma técnica para medir a função pulmonar e é assim útil para testar a eficácia de novos tratamentos. Em terceiro lugar, um protocolo padronizado …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os experimentos foram apoiados pelo Marga e Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Alemanha; Projeto 210-02-16 (maaaas), projeto 210-03-15 (maaaas) e pela Fundação de pesquisa alemã (DFG; AL1632-02; MAAAAS), Bonn, Alemanha; Centro de Medicina Molecular Colónia (CMMC; Hospital da Universidade de Colónia; Programa de avanço de carreira; MAAAAS,) Fortuna Köln (Faculdade de medicina, Universidade de Colónia; KD).

Materials

GlucoMen LX A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 38969 blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 39765 Test stripes
Glucose 20% B. Braun, Melsung, Germany 2356746
FinePointe Software DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-001
FPRC Controller DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1075-001
FPRC Aerosol Block DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-2306-001
Forceps FST, British Columbia, Canada 11065-07
Blunt scissors FST, British Columbia, Canada 14105-12
Micro scissors FST, British Columbia, Canada 15000-00
Perma-Hand 4-0 Ethicon, Puerto Rico, USA 736H Surgical suture
Roti-Histofix 4% Roth P087.1 4% Paraformaldehyd
Ketaset Zoetis, Berlin, Germany 10013389 Ketamine
Rompun 2% Bayer, Leverkusen, Germany 770081 Xylazine
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Referencias

  1. Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
  2. Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes?. International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
  3. Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
  4. Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
  5. Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
  6. Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
  7. Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
  8. Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
  9. Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
  12. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
  13. Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
  14. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
  15. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, (2008).
  16. Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
  17. Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
  18. Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
  19. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
  20. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
  21. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
  22. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, (2007).
  23. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
  24. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  25. Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
  26. Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
  27. Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
  28. Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
  29. Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
  30. Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance!. Eur Respir J. 30, 805 (2007).
  31. Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
  32. Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
  33. Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
  34. Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
  35. Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d’anesthesie. 40, 122-126 (1993).
  36. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
  37. Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
  38. Rolls, G. . Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
  39. Winsor, L., Woods, A., Ellis, R. Tissue processing. Laboratory histopathology. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
  40. Pearse, A. . Histochemistry, theoretical and applied. , (1980).
  41. Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
  42. Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
  43. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
  44. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).

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Citar este artículo
Dinger, K., Mohr, J., Vohlen, C., Hirani, D., Hucklenbruch-Rother, E., Ensenauer, R., Dötsch, J., Alejandre Alcazar, M. A. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. J. Vis. Exp. (133), e56685, doi:10.3791/56685 (2018).
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