JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Inmunología y contagio

Intraperitoneal glukose Tolerance Test, måling af lungefunktion og fiksering af lungerne at studere virkningerne af fedme og hæmmet metabolisme på pulmonal resultater

Published: March 15, 2018
doi:
10.3791/56685
, , , , , , ,
1Translational Experimental Pediatrics, Experimental Pulmonology, Department of Pediatrics and Adolescent Medicine,University of Cologne, 2Department of Pediatrics and Adolescent Medicine,University of Cologne, 3Division of Experimental Pediatrics and Metabolism, University Children’s Hospital,Heinrich Heine University Düsseldorf

Summary

Forekomsten af fedme er stigende og øger risikoen for kroniske lungesygdomme. For at fastsætte de underliggende mekanismer og forebyggende strategier, veldefinerede dyre modeller er nødvendige. Her give vi tre metoder (glucose-tolerance-test, krop plethysmography og lunge fiksering) at studere effekten af fedme på pulmonal resultater i mus.

Abstract

Fedme og luftvejssygdomme er store sundhedsmæssige problemer. Fedme er blevet en ny epidemi med et forventet antal over 1 milliard overvægtige personer på verdensplan frem til 2030, således udgør en voksende samfundsøkonomisk byrde. Samtidig, er fedme-relaterede co-morbiditet, herunder diabetes og hjerte samt kroniske lungesygdomme, konstant stigende. Selv om fedme er forbundet med øget risiko for astma-eksacerbationer, forværring af respiratorisk symptomer og dårlig kontrol, funktionelle rolle fedme og foruroliget metabolisme i patogenesen af kronisk lungesygdom er ofte undervurderet, og underliggende molekylære mekanismer er fortsat undvigende. Denne artikel har til formål at præsentere metoder til at vurdere effekten af fedme på stofskifte, samt lunge struktur og funktion. Her, vi beskriver tre teknikker for mus undersøgelser: (1) vurdering af intraperitoneal glukosetolerance (ipGTT) at analysere effekten af fedme på glukosemetabolismen; (2) måling af luftvejene modstand (Res) og åndedrætsorganerne overholdelse (Cdyn) at analysere effekten af fedme på lungefunktion; og (3) forberedelse og fiksering af lunge for efterfølgende kvantitativ histologisk vurdering. Fedme-relaterede lungesygdom er sandsynligvis multifaktoriel, skyldes systemisk inflammatorisk og metaboliske dysregulering, der potentielt negativt påvirker lungefunktion og respons på terapi. En standardiseret metode til at studere molekylære mekanismer og effekt af nye behandlinger er derfor afgørende.

Introduction

Ifølge World Health Organization (WHO) i 2008, var mere end 1,4 milliarder voksne, i alderen 20 og ældre, overvægtig med et body mass index (BMI) større end eller lig med 25; yderligere, mere end 200 millioner mænd og næsten 300 millioner kvinder var overvægtige (BMI≥30)1. Fedme og metaboliske syndrom er vigtige risikofaktorer for en lang række sygdomme. Mens fedme og samtidig øget hvidt fedtvæv masse har været tæt forbundet med type 2 diabetes2,3, hjerte-kar sygdomme, herunder koronar hjertesygdom (CHD), hjertesvigt (HF), atrieflimren4 og slidgigt5, deres funktionelle roller i patogenesen af luftvejslidelser forbliver dårligt forstået. Dog har epidemiologiske undersøgelser påvist, at fedme er stærkt forbundet med kroniske luftvejslidelser, herunder anstrengelses dyspnø, obstruktiv søvnapnø syndrom (OSAS), fedme hypoventilation syndrom (OHS), kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), lungeemboli, aspirationspneumoni og bronkial astma6,7,8,9. Potentielle mekanismer forbinder fedme og foruroliget stofskifte, fx, insulinresistens og type II diabetes, til patogenesen af kronisk lungesygdom ikke kun omfatter mekaniske og fysiske konsekvenser af vægt gevinst ved ventilation men også fremkalde en kronisk subakutte inflammatorisk tilstand10,11. Stigningen i fedme og lungesygdomme i det sidste tiår, kombineret med manglen på effektive forebyggende strategier og terapeutiske tilgange, fremhæver nødvendigheden af at undersøge de molekylære mekanismer for at definere nye muligheder for at styre fedme-relaterede lungekræft sygdomme.

Her, vi beskriver tre standard tests, som er vigtige grundlæggende at undersøge fedme og dens indvirkning på lunge struktur og funktion i musemodeller: (1) intraperitoneal glukose tolerance (ipGTT) (2) måling af luftvejene modstand (Res) og respiratorisk systemets kompatibilitet (Cdyn); og (3) forberedelse og fiksering af lunge for efterfølgende kvantitativ histologisk vurdering. IpGTT er en robust screeningstest foranstaltning glukoseoptagelse, og dermed effekten af fedme på stofskiftet. Enkelheden i metoden tillader god standardisering, og derfor sammenlignelighed af resultaterne mellem laboratorier. Mere sofistikerede metoder, såsom hyperglykæmisk klemmer eller undersøgelser på isolerede småøer, kan bruges til detaljeret analyse af metabolisk fænotype12. Her vurderer vi glukosetolerance for at definere en fedme-associeret stat af systemisk og metabolisk lidelse som grundlag for yderligere undersøgelser af en pulmonal resultatet. For at vurdere effekten af fedme og stofskiftesygdom på lungefunktion, målte vi luftvejene modstand (Res) og åndedrætsorganerne overholdelse (Cdyn). For at karakterisere lungesygdom, er uhæmmet samt behersket metoder til vurdering af lungefunktion tilgængelige. Uhæmmede plethysmography i frit flytte dyr efterligner en naturlig tilstand, som afspejler vejrtrækning mønstre; invasive metoder, såsom Indgangsimpedans måling af Res og cDyn i dybt bedøvede mus at vurdere dynamisk lunge mekanik, er derimod mere præcis13. Da kroniske luftvejssygdomme afspejles af histologiske ændringer af lungevæv, er ordentlig lunge fiksering til yderligere analyse forestående. Valget af metode til væv fiksering og forberedelse afhænger rum i lungerne, som vil blive undersøgt, for eksempel, gennemføre airways eller lunge parenkym14. Her, beskriver vi en metode, der giver mulighed for kvalitativ og kvantitativ vurdering af de strømførende airways at studere effekten af fedme på astma udvikling.

Protocol

Alle dyr, der blev gennemført i overensstemmelse med protokoller godkendt af lokale myndigheder (delstaten NRW, AZ: 2012.A424), og var i overensstemmelse med den tyske dyrevelfærd lov og forordninger om velfærd for dyr, der anvendes for eksperimenter eller for andre videnskabelige formål. Da lunge-funktionen analyse kan påvirke lunge struktur og derfor efterfølgende histologisk analyserer, bør måling af Res og Cdyn og forberedelse og fiksering af lunge for histomorfometri udføres i forskellige dyr. Måling af Re…

Representative Results

Repræsentative resultater af intraperitoneal glukose tolerance test (ipGTT) (figur 4), lunge-funktion test (figur 5), og repræsentant billeder illustrerer hæmatoxylin og eosin farves lungerne (figur 6). IpGTT blev udført på overvægtige mus (blå) efter 7 uger af høj-fedt-kost (HFD). Standard kost-fed mus fungerede som kontrolelemente…

Discussion

Denne rapport indeholder tre protokoller for tre forskellige metoder til at analysere virkningen af fedme på glukosemetabolismen og pulmonal resultater. Først, den glukose tolerance test giver mulighed for at analysere intracellulære glukoseoptagelse og kan være vejledende for insulinresistens. Andet, hele kroppen plethysmography er en teknik til at måle lungefunktion og dermed nyttigt at teste effekten af nye behandlinger. For det tredje er en standardiseret fiksering protokol afgørende for kvantitative morfometri…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forsøgene blev støttet af Marga og Walter Boll-Stiftung, Kerpen, Tyskland; Projekt 210-02-16 (MAAA), projekt 210-03-15 (MAAA) og af den tyske Forskningsfonds (DFG; AL1632-02; MAAA), Bonn, Tyskland. Center for Molekylær medicin Köln (CMMC; Universitetshospital Köln; Karriere avancement Program; MAAA), Köln formue (fakultetet for medicin, universitetet i Köln; KD).

Materials

GlucoMen LX A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 38969 blood glucose meter
GlucoMen LX Sensor A.Menarini diagnostics, Firneze, Italy 39765 Test stripes
Glucose 20% B. Braun, Melsung, Germany 2356746
FinePointe Software DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-002
FinePointe RC Single Site Mouse Table DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1831-001
FPRC Controller DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1075-001
FPRC Aerosol Block DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-1106-001
Aerogen neb head-5.2-4um DSI, MC s´Hertogenbosch, Netherlands 601-2306-001
Forceps FST, British Columbia, Canada 11065-07
Blunt scissors FST, British Columbia, Canada 14105-12
Micro scissors FST, British Columbia, Canada 15000-00
Perma-Hand 4-0 Ethicon, Puerto Rico, USA 736H Surgical suture
Roti-Histofix 4% Roth P087.1 4% Paraformaldehyd
Ketaset Zoetis, Berlin, Germany 10013389 Ketamine
Rompun 2% Bayer, Leverkusen, Germany 770081 Xylazine
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Kelly, T., Yang, W., Chen, C. S., Reynolds, K., He, J. Global burden of obesity in 2005 and projections to 2030. Int J Obes (Lond). 32, 1431-1437 (2008).
  2. Freemantle, N., Holmes, J., Hockey, A., Kumar, S. How strong is the association between abdominal obesity and the incidence of type 2 diabetes?. International journal of clinical practice. 62, 1391-1396 (2008).
  3. Wassink, A. M. J., et al. Waist circumference and metabolic risk factors have separate and additive effects on the risk of future Type 2 diabetes in patients with vascular diseases. A cohort study. Diabetic Medicine. 28, 932-940 (2011).
  4. Oktay, A. A., et al. The Interaction of Cardiorespiratory Fitness with Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Disease. Progress in cardiovascular diseases. , (2017).
  5. Azamar-Llamas, D., Hernandez-Molina, G., Ramos-Avalos, B., Furuzawa-Carballeda, J. Adipokine Contribution to the Pathogenesis of Osteoarthritis. Mediators Inflamm. 2017, 5468023 (2017).
  6. Koenig, S. M. Pulmonary complications of obesity. The American journal of the medical sciences. 321, 249-279 (2001).
  7. Stunkard, A. J. Current views on obesity. The American journal of medicine. 100, 230-236 (1996).
  8. Murugan, A. T., Sharma, G. Obesity and respiratory diseases. Chron Respir Dis. 5, 233-242 (2008).
  9. Zammit, C., Liddicoat, H., Moonsie, I., Makker, H. Obesity and respiratory diseases. International journal of general medicine. 3, 335-343 (2010).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. McArdle, M. A., Finucane, O. M., Connaughton, R. M., McMorrow, A. M., Roche, H. M. Mechanisms of obesity-induced inflammation and insulin resistance: insights into the emerging role of nutritional strategies. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 52 (2013).
  12. Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Disease models & mechanisms. 3, 525-534 (2010).
  13. Bates, J. H., Irvin, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping uncertainty principle. J Appl Physiol. 94 (1985), 1297-1306 (2003).
  14. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. Am J Respir Crit Care Med. 181, 394-418 (2010).
  15. Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in aseptic rodent surgery. Curr Protoc Immunol. Chapter 1, (2008).
  16. Heydemann, A. An Overview of Murine High Fat Diet as a Model for Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of diabetes research. 2016, 2902351 (2016).
  17. Asha, G. V., Raja Gopal Reddy, M., Mahesh, M., Vajreswari, A., Jeyakumar, S. M. Male mice are susceptible to high fat diet-induced hyperglycaemia and display increased circulatory retinol binding protein 4 (RBP4) levels and its expression in visceral adipose depots. Archives of physiology and biochemistry. 122, 19-26 (2016).
  18. Jovicic, N., et al. Differential Immunometabolic Phenotype in Th1 and Th2 Dominant Mouse Strains in Response to High-Fat Feeding. PLoS One. 10, e0134089 (2015).
  19. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to Background Strain Is Essential for Metabolic Research: C57BL/6 and the International Knockout Mouse Consortium. Diabetes. 65, 25-33 (2016).
  20. Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, E15-E26 (2008).
  21. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. Journal of lipid research. 46, 582-588 (2005).
  22. Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Current protocols in molecular biology. Chapter 29, (2007).
  23. McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297, E849-E855 (2009).
  24. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
  25. Lodhi, I. J., Semenkovich, C. F. Why we should put clothes on mice. Cell Metab. 9, 111-112 (2009).
  26. Swoap, S. J., Gutilla, M. J., Liles, L. C., Smith, R. O., Weinshenker, D. The full expression of fasting-induced torpor requires beta 3-adrenergic receptor signaling. J Neurosci. 26, 241-245 (2006).
  27. Geiser, F. Metabolic rate and body temperature reduction during hibernation and daily torpor. Annu Rev Physiol. 66, 239-274 (2004).
  28. Mead, J. Mechanical properties of lungs. Physiological reviews. 41, 281-330 (1961).
  29. Lundblad, L. K., Irvin, C. G., Adler, A., Bates, J. H. A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice. J Appl Physiol. 93, 1198-1207 (2002).
  30. Lundblad, L. K., et al. Penh is not a measure of airway resistance!. Eur Respir J. 30, 805 (2007).
  31. Adler, A., Cieslewicz, G., Irvin, C. G. Unrestrained plethysmography is an unreliable measure of airway responsiveness in BALB/c and C57BL/6 mice. J Appl Physiol. 97, 286-292 (2004).
  32. Fairchild, G. A. Measurement of respiratory volume for virus retention studies in mice. Applied microbiology. 24, 812-818 (1972).
  33. Brown, R. H., Wagner, E. M. Mechanisms of bronchoprotection by anesthetic induction agents: propofol versus ketamine. Anesthesiology. 90, 822-828 (1999).
  34. Goyal, S., Agrawal, A. Ketamine in status asthmaticus: A review. Indian journal of critical care medicine: peer-reviewed, official publication of Indian Society of Critical Care Medicine. 17, 154-161 (2013).
  35. Doi, M., Ikeda, K. Airway irritation produced by volatile anaesthetics during brief inhalation: comparison of halothane, enflurane, isoflurane and sevoflurane. Canadian journal of anaesthesia = Journal canadien d’anesthesie. 40, 122-126 (1993).
  36. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 299, L843-L851 (2010).
  37. Weibel, E. R., Limacher, W., Bachofen, H. Electron microscopy of rapidly frozen lungs: evaluation on the basis of standard criteria. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 516-527 (1982).
  38. Rolls, G. . Process of Fixation and the Nature of Fixatives. , (2017).
  39. Winsor, L., Woods, A., Ellis, R. Tissue processing. Laboratory histopathology. , 4.2-1-4.2-39 (1994).
  40. Pearse, A. . Histochemistry, theoretical and applied. , (1980).
  41. Weibel, E. R. Morphological basis of alveolar-capillary gas exchange. Physiological reviews. 53, 419-495 (1973).
  42. Bur, S., Bachofen, H., Gehr, P., Weibel, E. R. Lung fixation by airway instillation: effects on capillary hematocrit. Experimental lung research. 9, 57-66 (1985).
  43. Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations. Journal of applied physiology: respiratory, environmental and exercise physiology. 53, 528-533 (1982).
  44. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary topics in laboratory animal science. 43, 42-51 (2004).

Tags

Intraperitoneal Glucose Tolerance TestLung Function MeasurementLung FixationObesityImpaired MetabolismPulmonary OutcomesRespiratory ResearchMetabolic DisordersLung StructureLung FunctionChronic Lung DiseasesTherapeutic ApproachesCOPDAsthmaFasted Blood GlucoseGlucose InjectionLung Function AssessmentAnesthesiaAnimal Models

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Dinger, K., Mohr, J., Vohlen, C., Hirani, D., Hucklenbruch-Rother, E., Ensenauer, R., Dötsch, J., Alejandre Alcazar, M. A. Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes. J. Vis. Exp. (133), e56685, doi:10.3791/56685 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image