Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Methoden, um die auditory Brainstem Antwort vom postnatalen Ratte Welpen aufnehmen. Um die funktionelle Entwicklung des äußeren Haarzellen zu untersuchen, ist das experimentelle Verfahren der gesamten Zelle Patch Clamp Aufnahme in isolierten äußeren Haarzellen Schritt für Schritt beschrieben.
Abstract
Die äußeren Haarzellen ist eines der zwei Arten von sensorischen Haarzellen in der Säugetier-Cochlea. Sie verändern ihre Zelle Länge mit dem Rezeptor potential um die schwache Vibration der Low-Level-akustisches Signal zu verstärken. Die Morphologie und elektrophysiologische Eigentum der äußeren Haarzellen (OHCs) im frühen postnatalen Alter zu entwickeln. Die Reifung der äußeren Haarzellen kann zur Entwicklung des auditorischen Systems. OHCs Entwicklungsprozess ist jedoch nicht gut untersucht. Dies ist zum Teil wegen der Schwierigkeit, ihre Funktion an eine elektrophysiologische Ansatz zu messen. Mit dem Ziel der Entwicklung einer einfachen Methode zur Lösung des obigen Problems, beschreiben wir hier eine Schritt für Schritt Protokoll, um die Funktion des OHCs in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Mit dieser Methode können wir bewerten die Cochlea-Reaktion auf reinen Ton Reize und untersuchen die Ausdruck Ebene und die Funktion der motorischen Protein Prestin in OHCs. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die inneren Haarzellen (IHC) zu untersuchen.
Introduction
Zwei unterschiedliche Funktionen von Cochlea-sensorischen Haarzellen sind für Säugetiere hören: Mechanoelectric Transduktion (MET) und Electromotility1,2. Durch MET-Kanäle in das Haarbündel, IHC (IHC) und OHCs konvertieren Klangschwingung Membran potenzielle Veränderungen sowie die elektrischen Signale der innervierten Spirale Ganglion Neuronen gelegen. OHCs ihre Zelle Länge mit dem Membranpotential ändern und die Schwingung des Low-Level-Sound zu verstärken. Diese Tätigkeit als Electromotility bezeichnet wird durch den motor Protein Prestin befindet sich in der Seitenwand des OHCs3abgeleitet.
In vielen Arten, einschließlich der Nagetiere ist die Anhörung Funktion unreif in frühen postnatalen Epoche4,5. Kein Aktionspotential in Reaktion auf akustische Signale konnte im auditorischen Kortex vor der mündlichen Verhandlung Anfang6,7nachgewiesen werden. Entwicklung der Morphologie und Funktion der Cochlea ist weit verbreitet in Maus, Rennmaus und Ratte4,5,8untersucht worden. Der mechanotransduktion und Electromotility der Haarzellen entstehen auch in den frühen Leben Epoche5.
Um die Hörfähigkeit Empfindlichkeit von Ratten in verschiedenen Altersstufen postnatale zu bewerten, haben wir eine Methode für auditory Brainstem Response (ABR) Aufnahme in Ratte Welpen entwickelt. Ganze Zelle Patch-Clamp ist eine ideale Technologie um die OHCs Elektrophysiologisch untersuchen. Allerdings begrenzt die niedrige Rate der gesamten Zelle Versiegelung im Vergleich mit der Patch-Clamp in Neuronen und anderen epithelialen Zellen durchgeführt, die Untersuchung der Electromotility der isolierten OHCs.
Hier beschreiben wir ein Verfahren um die OHCs morphologisch und Elektrophysiologisch in akut dissoziierten Cochlea von postnatale Ratten zu untersuchen. Diese Methode kann geändert werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die inneren Haarzellen Entwicklung und Funktion regulieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei Ratten jünger als 11. Tag konnte kein Aktionspotential in Reaktion auf klangstimulation im auditorischen Kortex6,7beobachtet werden. Daher bezeichnet man als “Anhörung Ausbruch”10postnatale Tag 11. Die Entwicklung des Gehörs vor Beginn der mündlichen Verhandlung noch nicht gut untersucht wurde. Ähnliche Methode für Erwachsene ABR Aufnahme, wir zeigen, dass ABRs durch reinen Ton Burst Ratte Welpen jünger als P11 ausgelöst werden…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem 973 Programm (2014CB943002) und die National Natural Science Foundation of China (11534013, 31500841) unterstützt.
Materials
| Anesthetic | |||
| Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 1.5% in water |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| Collagenase IV | Sigma | C5138 | 2 mg/mL in L-15 |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining solutions | |||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | PH 7.3 |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | 4% in PBS |
| Triton X-100 | Amresco | ZS-0694 | 0.3% in PBS |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | 10000C | 10% in PBS |
| prestin antibody | Santa Cruz | SC-22694 | dil 1:200 |
| Alexa Fluor 488-conjugated antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | dil 1:600 |
| Phalloidin-Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | dil 1:200 |
| DAPI | Solarbio | C0060 | dil 1:20 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Extracellular solution | |||
| Leiboviz's L-15 Medium | Life Technologies | 41300-039 | 1 pack in 1 L water |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| CsCl | Sigma | 7647-17-8 | 140 mM |
| MgCl2 | Sigma | 7791-18-6 | 2 mM |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | 10 mM |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | 10 mM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Osmometer | Gonotec | OSMOMAT 3000 basic | |
| Forcep | WPI | 14095 | Tweezers dumont |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | MODLE-P97 | |
| Micro Forge | Narishigen | MF-830 | |
| Mini Operating System | Sutter Instrument | MP-285 | |
| MultiClamp | Axon | 700B | |
| Low-Noise Data Acquisition System | Axon | 1440A | |
| ES1 speaker | Tucker-Davis Technologies | ||
| TDT system 3 | Tucker-Davis Technologies | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| BioSigRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| jClamp | Scientific Solutions | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| SD rat | Experimental Animal Center of Southern Medical University |
Referencias
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