تلفيق من الآبار المخصصة [اغروس] لبذر الخلية والأنسجة خاتم التجميع الذاتي باستخدام قوالب طباعة 3D
Summary
ويصف هذا البروتوكول منبرا لاختلاق خواتم الأنسجة الذاتي تجميعها في أحجام متغير باستخدام قالب بلاستيكية مخصصة طباعة 3D. يشفي PDMS السلبيات في قالب طباعة 3D؛ ثم يلقي في السلبيات PDMS شُفي [اغروس]. هي خلايا المصنف في الآبار [اغروس] الناتجة عن ذلك حيث أنها تتجمع في الأنسجة خواتم.
Abstract
هندسة الأنسجة تستخدم سريرياً لاستبدال وإصلاح الأنسجة، ويجري كأدوات للكشف عن المخدرات والأمراض البشرية النمذجة. الأنسجة الذاتي تجميعها توفر مزايا أكثر من هندسة النسيج المستندة إلى سقالة، مثل ترسب مصفوفة محسنة والقوة، والدالة. ومع ذلك، هناك بعض الأساليب المتاحة لاختلاق أنسجة ثلاثية الأبعاد دون زرع الخلايا أو في غضون سقالة داعمة. سابقا، وضعنا نظاما لاختلاق خواتم الأنسجة الذاتي تجميعها بزرع الخلايا في الآبار غير لاصق [اغروس]. أولاً كان يلقي من بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) سلبية في العفن البولي تشكيلة، وثم كان تبلور [اغروس] في PDMS السلبية لإنشاء خلية على شكل خاتم البذر الآبار. ومع ذلك، كان محدودا براعة في هذا النهج بقرار الأدوات المتاحة لتصنيع الآلات العفن البولي. هنا، علينا أن نظهر أن طباعة 3D البلاستيكية يمكن استخدامها كبديل للبولي تشكيلة لاختلاق السلبيات PDMS. طباعة 3D العفن والعفن المنقح تصميم سهلة الاستخدام وغير مكلفة لإنتاج، ويتطلب كثير أقل [اغروس] PDMS كل خلية البذر جيدا. لقد أظهرنا أن الآبار [اغروس] الناتجة يمكن استخدامها لإنشاء حلقات الأنسجة الذاتي تجميعها مع أقطار مخصصة من مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا. ثم يمكن استخدام حلقات لتحليل الميكانيكية والفنية وغذائها، أو لاختلاق الأنسجة أنبوبي أكبر حجماً وأكثر تعقيداً.
Introduction
الهاتف الخلوي التجميع الذاتي النهج إلى اختﻻق الأوعية الدموية الأنسجة المهندسة بديل للنهج القائم على سقالة. قد يكون تجميعها ذاتيا، وخالية من سقالة الأنسجة أكبر كثافة الخلية وترسب مصفوفة محسنة والقوة وتحسين الوظيفة البيولوجية المقارنة على أساس سقالة الأنسجة1،2،3،4 . ومع ذلك، تشكل أنسجة ثلاثية الأبعاد دون استخدام الدعم سقالة خارجية مع أشكال وأحجام معينة لا يزال يشكل تحديا. بعض أساليب الصمامات معا طبقات من أوراق الخلية لتشكيل بنيات أكثر سمكا، على الرغم من أن هذه العملية يمكن أن تكون مضيعة للوقت والعمل المكثف5. بدلاً من ذلك، التي يمكن أن تبذر في قوالب غير لاصقة الخلايا ويسمح للتجميع في الماغنيسيوم وخواتم وغيرها الأنسجة الأشكال6،،من78.
خواتم الأنسجة الذاتي تجميعها يتطلب أقل من الخلايا وأقصر ثقافة العصر، والكواشف أقل مما أفسح أنبوبي هندسة الأنسجة، ولكن يمكن لا يزال ميكانيكيا اختبارها، درست الأشيع، أو استخدامها contractility و التجارب الأخرى الفنية7 , 9 , 10 , 11-لأنها يمكن أن سرعة ملفقة واختبارها بسهولة، خواتم الأنسجة مثالية لفحص عدد كبير من معلمات الثقافة، ولديها إمكانات لاستخدامها ك نماذج المرض11 أو أدوات للمخدرات فحص12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تنصهر فيها عصابات في هياكل الأنسجة أكثر تعقيداً مثل الأوعية الدموية أو القصبة الهوائية7،13، وقد تلتحم الحلقات تماما أكثر من الأشكال الأخرى مثل الماغنيسيوم14،15.
[اغروس] يستخدم على نطاق واسع كمادة العفن لاختلاق الأنسجة تجميعها ذاتيا نظراً لتوافق مع الحياة، النفاذية، وخصائص الخلية غير لاصقة. على سبيل المثال، ملفقة نورت et al. [اغروس] قوالب من قضبان مقذوف، مما مكن سيطرة محدودة على شكل العفن والمعدات المتخصصة اللازمة15. وأودعت تان وآخرون قطرات الجينات كبناء وحدات لصنع قوالب مخصصة المائية في مختلف الأشكال (الهرم، ساحة)16. ومع ذلك، أسفرت كبيرة قطرها من الماغنيسيوم الجينات (300 ميكرون) الميزات مع دقة منخفضة. قد يؤدي مثل هذا قرار منخفض العفن متفاوتة الأسطح التي يمكن أن تؤثر سلبيا على الخلية تجميع الاتساق. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يلقي [اغروس] إلى السلبيات البوليمر لإنشاء قوالب غير لاصقة مع الميزات سلاسة وأبعاد محددة6،،من717.
نحن ذكرت سابقا نظاما لاختلاق الآبار البذر الخلية المخصصة [اغروس] حلقية من الجبس PDMS سلبية في7،العفن البولي ناعم18. [اغروس] تدفقت السلبية PDMS والسماح بتعيين7،18. كانت المصنف الخلايا في آبار [اغروس]، حيث أنها تجمع بشكل ذاتي تجميعها، ثم حلقات خالية من سقالة الأنسجة في أقل من 24 ساعة7،18. السلبيات PDMS أوتوكلافابلي، ويمكن إعادة استخدامها مرات عديدة، وهي لينة ومرنة، مما يجعل من السهل لإزالة الآبار طدت [اغروس]. عندما أبلغ هذا النظام في البداية في جويتير et al. كان يلقي من السلبيات PDMS 7، ناعم قوالب البولي (الشكل 1A). بعد [اغروس] الصب، قطع الآبار بذر خلية منفردة ووضعها في الآبار7،12-جيدا لوحة18. في الآونة الأخيرة تعديل التصميم قالب واحد [اغروس] تنتج 5 حلقات وتناسبها في بئر لوحة 6، حسنا، مما يلغي الحاجة قطع الآبار الفردية وتقليل كمية PDMS واللازمة لإنتاج كل حلقة (الشكل 1B) [اغروس]. واستخدمت خلية أصغر البذر عرض الحوض تقليل عدد خلايا المصنف المطلوب لتحقيق تشكيل عصابة. وعلى الرغم من هذه التغييرات، القرار وتخصيص قوالب كانت تقتصر على أبعاد اندميل القياسية المتوفرة، ومن ميكروميلينج يمكن أن تكون باهظة التكاليف. بالإضافة إلى ذلك، الكمبيوتر التحكم العددي (الحاسب الآلي) بالقطع يمكن أن تكون مضيعة للوقت ومرهقة بسبب الحاجة إلى تخصيص وقت في بشدة استخدام معدات مخصصة، وبرامج إضافية التصنيع بمساعدة الكمبيوتر (كام) لتحويل (التصميم بمساعدة الكمبيوتر ملف CAD) إلى مسار أداة للبرمجة، وموثوق بها فيكستورينج الجزء البولي أثناء القطع.
في هذه الدراسة، قمنا بدراسة استخدام 3D الطباعة كبديل للتصنيع باستخدام الحاسب الآلي. الطباعة ثلاثية الأبعاد يستخدم على نطاق واسع للهندسة يزرع مخصصة، اختﻻق سقالة المواد، والطباعة مباشرة من الخلايا والأنسجة الماغنيسيوم15،،من1920. قمنا باستخدام طابعة 3D عالية الدقة، والمتخصصة 3D طباعة المواد التي مكنتنا من طباعة قالب جامد مع سلس، إنهاء سطح لامع (انظر الجدول للمواد). لدينا تقنية تسمح لتصنيع قوالب بلاستيكية عالية للتخصيص، وذات الدقة العالية التي يمكن أن تستخدم لصب السلبيات PDMS والآبار [اغروس]. ويرد في الشكل 1تكرارات التصميم. كذلك تم تعديل تصميم العفن في النسخة المطبوعة 3D العفن لتشمل الجدران الخارجية مدبب وثقب مركز بغية تخفيف إزالة كل السلبيات PDMS من قوالب طباعة 3D والآبار [اغروس] من السلبيات PDMS. لا يمكن تحقيق هذه الميزات مدبب مع معيار القطع العمليات. تم زيادة المسافة من الجزء السفلي من الآبار إلى الجزء السفلي من القالب في هذا التكرار، أسفر عن قاعدة أدناه الوظائف الحد من مخاطر وظيفة كسر أثناء إزالة جيدا [اغروس] [اغروس] أكثر سمكا. ويرد الإجراء تلفيق العفن وخاتم تخطيطياً في الشكل 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا وقد قدمنا أسلوب متعدد الاستخدامات لتصنيع خواتم الأنسجة الذاتية المجمعة السريع مع الأبعاد مخصصة بسهولة باستخدام 3D الطباعة. لدينا أسلوب مشابه للذي ذكرته في سفورونوس وآخرون. 6 ، حيث استخدمت طباعة 3D قرص العسل وقوالب الشمع على شكل الكلب والعظام ليلقي السلبيات PDMS. ومع ذلك، تم تعديل في القوالب تحتوي على العديد من ميزات تصميم فريد من نوعه. يوفر درجة (الشكل 4 أ(1)) التوجه للعفن للسماح لكل حلقة يكون المسمى ورصدها على حدة. ثقب مركزي (الشكل 4 أ(2)) يساعد على تحسين نشر المتوسطة في الآبار. يتم طباعة أرقام الملف CAD مباشرة على القالب؛ ولذلك، السلبيات PDMS تتم تسمية كل منهما مع رقم الإصدار وآخر قطره (الشكل 4A3). الجدران الخارجية مدبب (الشكل 3(1)، 5 درجات)، في الجزء العلوي من أحواض جيدا (الشكل 3(2)، 45 °)، وثقب مركزي (الشكل 3(3)، 5 º) تجعل من السهل لإزالة السلبيات PDMS من قوالب طباعة 3D ، وأسهل لإزالة من السلبيات PDMS الآبار [اغروس] (4A الرقم(2)، A(4)).
لقد أظهرنا براعة في هذا النظام بتلفيق الأنسجة الذاتي تجميعها على شكل حلقة من مجموعة متنوعة من أقطار وأنواع الخلايا، بما في ذلك العضلات الملساء البشرية الأولية الخلايا (سمكس)18،22، الفئران الابهري سمكس7 , 23والخلايا الجذعية البشرية الوسيطة (همسكس)13سمكس المستمدة من المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس)11 (الجدول 1). في العمل الجاري، نحن تقييم تشكيل عصابات من أنواع الخلايا الإضافية مثل خلايا بطانية، والصمامات الغضروف حلقات ذات أحجام مختلفة للتطبيقات المحتملة في استبدال القصبة الهوائية. بالإضافة إلى بنيات تماما المستمدة من الخلية، استخدمنا أيضا هذا النظام إلى اختﻻق خواتم مع الجيلاتين cross-linked أدرجت الجزئي المجالات الخرز الصغير13،22. الجزئي المجالات الخرز الصغير يمكن إدراجها ضمن حلقات الأنسجة أثناء التجميع الذاتي لتوفير قوة ميكانيكية إضافية، أو للتسليم لعوامل النمو13،22مترجمة.
عندما اختﻻق خواتم الأنسجة، قد يكون الأمثل لعدد الخلايا المطلوبة لأنواع مختلفة من الخلايا. خلية الدنيا قد تختلف الأرقام استناداً إلى حجم ونوع من الخلايا. على سبيل المثال، هي المصنفة هسمكس المستمدة من إيبسكس في 600,000 الخلايا/حلقة11، همسكس وهسمكس الأولية هي تبذر في الخلايا/خاتم 400,00013،22، والفئران سمكس الابهر هي تبذر في 500,000 الخلايا/حلقة18. أبعاد الحوض قد تؤثر أيضا على تشكيل عصابة والحد الأدنى لعدد الخلايا المطلوبة ل تشكيل حلقة24. واستخدمت للدراسات مع الخلايا البشرية وقوالب طباعة 3D، عرض حوض 2 مم. قوالب البولي الأصلي قد عرض حوض 3.75 ملم، والتي تتطلب هسمكس 750,000 لتشكيل عصابة خلية 2 مم18. مع العرض انخفاض الحوض الصغير، تمكنا من خفض عدد الخلايا اللازمة لتشكيل عصابة من 46 في المائة إلى خلايا 400,000 كل حلقة25. ويرد في الجدول 1كميات من خلايا المصنف كل حلقة.
عند اختيار مواد المطبوعة 3D، تحتاج إلى العديد من العوامل التي سينظر فيها. لأنه عادة ما يشفي PDMS عند 60 درجة مئوية، المواد المطبوعة 3D التي يجب أن يكون لديك عالية ما فيه الكفاية ذوبان درجة الحرارة لتجنب الضرر أثناء علاج PDMS. درجة حرارة الانصهار للمواد المستخدمة في هذه الدراسة (مادة ملكية، انظر الجدول للمواد) غير متوفر. ومع ذلك، عند خبز عند 60 درجة مئوية ح 1، لاحظنا أن المواد قد بدأت تنتج رائحة. وهكذا، قررنا خفض علاج درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية وزيادة وقت المعالجة لخبز PDMS دون الأضرار بالمواد المطبوعة 3D. التعديلات في علاج الوقت قد يكون ضروريا إذا كان يتم تعديل القوالب بشكل أكبر PDMS السلبيات. يمنع فترة علاج إضافية عند 60 درجة مئوية بعد إزالة PDMS من قوالب طباعة 3D المتبقية مبتذل، بينما يحد من درجة حرارة القالب طباعة 3D يتعرض ل PDMS النهائية السلبية. لاحظ أن بعض مواد تمنع علاج PDMS، حتى التأكد من أن المواد المحددة متوافق مع PDMS. وأخيراً، يجب أيضا النظر في سمية المواد العفن. بينما لن يكون القالب طباعة 3D في اتصال مباشر مع الخلايا، فمن الممكن أن بعض بقايا من العفن يمكن نقلها إلى PDMS السلبية أثناء عملية التجفيف. وجدنا أن الغسيل دقيق جداً مع المنظفات كان كافياً لإزالة أي بقايا من PDMS السلبية. ومع ذلك، لاحظنا سابقا أن الغسيل غير كافية أدت إلى تشكيل عصابة الفقراء في الآبار [اغروس] للمرة الأولى القليلة في الأغراض PDMS السلبية. استخدام PDMS المدلى بها من غيرها من المواد المطبوعة 3D قد تتطلب إجراء مزيد من التحقيقات للتأكد من أن المنظفات كافية لإزالة بقايا العفن، بما في ذلك أي موجودة المحتملة. قد يكون الاختبار الدوري أيضا ضرورية، كما من الممكن أن تتكرر تدفئة دورات (حتى إلى 50 درجة مئوية) قد تلف القالب مع مرور الوقت، ويؤدي إلى زيادات في بقايا بعد الاستخدام المتكرر. وحتى الآن، أننا استخدمنا العفن 3D مطبوعة واحدة لإنتاج أكثر من 30 PDMS السلبيات التي استخدمت لإنشاء حلقات الأنسجة بنجاح.
الطباعة عموما، 3D يتيح مرونة أكبر لتصنيع قوالب [اغروس] من القطع من البولي. يوفر دقة أعلى مما هو ممكن مع الأدوات، ولا يقتصر قالب تصميم بإبعاد الأدوات المتاحة. وهذا يسمح لمزيد من التخصيص، وإضافة ميزات مثل مستدق التي قد لا يكون ممكناً مع الآلات. يمكن تطبيق هذا النظام إلى اختﻻق الأنسجة الذاتية المجتمعون في الأشكال الأخرى أيضا، بالإضافة إلى حلقات6،17. استخدام أسلوب تصنيع خاتم، قمنا بتطوير الحلقات الأنسجة من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وأحجام للتطبيقات المحتملة في هندسة الأنسجة الرغامى13والأوعية الدموية المهندسة7، ونمذجة أمراض الأوعية الدموية11.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نعترف بامتنان الدكتورة إيريكا ستولتس (البحوث الأكاديمية وعالم التطبيق، WPI خدمات تكنولوجيا المعلومات) لتقديم المساعدة لها مع 3D الطباعة، أماندا زوي ريدينجير، دكتوراه، كريس نيكز وليفي كارين، الشرق الأوسط، لإسهامهم في قالب تصميم، سوكوي كاثي وجنيفر مان للمساعدة على اختبار تصميمات العفن، ومايكل أوكيف لمساعدته مع التصوير. أيد هذا العمل NSF إيجيرت تأيين 1144804 (MWR، قد)، المعاهد الوطنية للصحة R15 HL097332 (MWR، تاه)، EEC0754996 منتدبين جبهة الخلاص الوطني (با)، والمعاهد الوطنية للصحة 1R01 EB023907 (MWR، قد)، والمعاهد الوطنية للصحة R15 HL137197 (MWR، قد).
Materials
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50040 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
| VeroWhite | StrataSys | RGD835 | |
| 3D printer | StrataSys | Objet 260 Connex | |
| DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
| FBS | Thermo Fisher | 16000069 | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-015-CI | |
| Non-essential amino acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| Pen-strep | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| 6-well plate | Corning | 353046 | |
| WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells | Provided by T. Wight [ref 21] | N/A |
Referencias
- L’Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).
- Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings. J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).
- Hayashi, K., Tabata, Y. Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions. Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).
- Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).
- McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373, 1440-1446 (2009).
- Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues. Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).
- Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
- Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
- Laterreur, V., et al. Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes. J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).
- L’Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).
- Dash, B. C., et al. Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells. Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).
- Heureux, N., et al. A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses. FASEB J. 15, 515-524 (2001).
- Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs. Biomaterials. 52, 452-462 (2015).
- Twal, W. O., et al. Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs. Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
- Tan, Y., et al. 3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication. Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).
- Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).
- Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering. J Vis Exp. (57), e3366 (2011).
- Zhu, W., et al. 3D printing of functional biomaterials for tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).
- Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
- Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).
- Strobel, H. A., et al. Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings. Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).
- Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels. JBMR Part B. , (2017).
- Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels. Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).
- Gwyther, T. . Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , (2012).
