JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

Published: February 02, 2018
doi:
10.3791/56613
, , , , ,
1Department of Medicine II, Klinikum rechts der Isar,Technische Universität München, 2Department of Pneumology, Center for Medicine,Medical Center University of Freiburg

Summary

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon dayalı Tümleştirme vektörlerin sağlar fare tetkikine istikrarlı transfection içinde vivo. Burada, tek bir transgene uzun vadeli kurucu ifade veya kombine kurucu ve Doksisiklin indüklenebilir ifade bir transgene veya miR-shRNA karaciğerde sağlayan pratik bir protokol transfection sistemler mevcut.

Abstract

Karaciğer kanseri, rejenerasyon, inflamasyon ve fibrozis araştırma modelleri esnek sistemler içinde vivo gen ekspresyonu ve susturmak için son derece yararlıdır. Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon transposon tabanlı yapıları, hepatositlerin yetişkin farelerde genetik manipülasyon için verimli bir yöntemdir. Kurucu transgene ifade ek olarak, bu sistem shRNA-aracılı gen knock-down, dolaylı, gen mutasyonlarının ikna etmek için CRISPR/Cas9 sistem veya indüklenebilir sistemleri gibi daha gelişmiş uygulamalar için kullanılabilir. Burada, bünye CreER ifade ile birlikte bir transgene indüklenebilir ifade birleşimi veya miR-shRNA tercih Bu teknik bir örnek olarak sunulur. Uyuyan güzelhazırlanması başlangıç Multi-step yordamı kapak-transposon oluşturur, enjeksiyon ve tedavi farelerin ve analiz için karaciğer dokusu hazırlanması için immunostaining tarafından. Sunulan sistem tetkikine karmaşık genetik manipülasyon elde etmek için güvenilir ve etkili bir yaklaşımdır. Cre/loxP tabanlı fare suşları ile birlikte özellikle yararlıdır ve karaciğer hastalığının araştırmasında modeller çeşitli uygulanabilir.

Introduction

Kronik karaciğer hastalığı önemli sağlık yük dünya çapında1sunar. Hayvan araştırma modelleri karaciğer hastalığı çalışmanın temel araçlar ve karaciğer rejenerasyonu, karaciğer iltihabı ve yağlanma yanı sıra karaciğer kanseri2karmaşık sorulara cevap yardımcı oldu. Bu hayvan modellerin önemli bazı karaciğer hücreleri genetik değişiklik olmasına bağlıdır. Bu nedenle, yararlı3gen ekspresyonu tetkikine içinde işlemek için verimli araçlar bulunmaktadır. Kurulan yolu üreme genetiği fare suşları veya viral vektörler oluşturulmasında Hepatosit enfeksiyon gibi zaman alıcı, her iki liman güvenlik endişeleri, veya tetkikine vivo içinde zavallı transgene ifade verim 4 , 5. hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon (HTVI) bırakmak için kolay, hızlı ve maliyet-etkin sorgu karaciğerde gen işlevinin tetkikine vivo içinde transfection için alternatif bir yöntem olduğunu. HTVI için istenen DNA dizisi taşıyan bir vektör serum enjekte hayvanın vücut ağırlığının % 10’una karşılık gelen bir birimdeki feshedilmiştir. Çözüm sonra 5-10 s6içinde kuyruk damar içine enjekte edilir. Kardiyak çıkış aşan, serum karaciğer genişlemesi ve hidrodinamik transfection tetkikine7‘ nin önde gelen karaciğer damarlar içine inferior vena kava akar. İstikrarlı genomik entegrasyonu sağlamak için yöntem transposon tabanlı vektörel çizimler, güzellik – uykutransposon sistemi gibi ile birleştirilmiştir. Bu sistemler bir güzellik – uykutransposase8,9tarafından katalize genomik rekombinasyon siteleri ile hedef vektörel çizimler rekombinasyon aracılık. Karaciğer fibrozis ya da karsinojenezis modeller için bu kez overexpress veya sessizlik genlerin hastalık modeli belirli zaman noktalarda için arzu edilir. Bu amaçla indüklenebilir gen ekspresyonu Cre/LoxP-sistem veya tetrasiklin-indüklenebilir gen ifade system için araçları kullanılan10(Tet-On) olabilir.

Burada, HTVI bir uyuyan güzel transposon tabanlı sistemi kullanarak fare tetkikine vivo içinde transfection için bir protokol açıklayın. Bir karaciğer özgü organizatörü kontrol altında bir transgene istikrarlı, kurucu ifade bir protokolüne ek olarak, biz bünye tamoxifen bağımlı Cre recombinase (CreER) ifade ile birleştirir daha gelişmiş bir vektör sistemi tarif bir transgene veya shRNA (miR-shRNA), mikroRNA adapte indüklenebilir ifade denilen pTC TET-sistem11. Bu vektör sisteminde indüklenebilir transgenes veya miR-shRNAs tetrasiklin bağımlı ifade için bir recombinational klonlama sisteminde, yeni vektörel çizimler12hızlı ve kolay nesil ile omurga vektör içine klonlanır. Bu video tabanlı kılavuz indüklenebilir transgene/miR-shRNA ifade ulaşmak için hazırlanması uygun vektörel çizimler, enjeksiyon ve farelerde tedavi ve sonunda analiz için karaciğer dokusunun hazırlık kapsar. Bu protokol için açıklanan yöntemi fare sistemiyle ifade Cre/loxP aracılı herhangi bir kombinasyonu veya knock-down tercih, yapım o bir yerde geçerli sistem karaciğer hastalığı araştırmada herhangi bir gen etkinleştirmek için tasarlanmıştır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri için bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanım esaslarına göre gerçekleştirilen ve sorumlu yetkilileri (Regierung von Oberbayern, Münih, Almanya ve Stanford hayvan Kurulusları ve kullanma, Komitesi tarafından kabul edildi Stanford, CA, Amerika Birleşik Devletleri). (Adım 1’den 4) klonlama için tüm plazmid listesi ek tablosunda S1 sağlanır. 1. kurucu gen ekspresyonu için bir Transgene klonlama Astar transgene amplifikasyon13…

Representative Results

Transfection etkinliği hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonla: Hydrodynamically tarafından tek bir enjeksiyon transfected fare tetkikine yüzdesi değişkendir ve enjeksiyon hacmi, enjeksiyon zaman, enjekte DNA miktarı ve enjekte yapı6boyutu gibi birden çok parametre bağlıdır, 22,23. Ayrıca, transfection verimliliği genellikle nerede bir büyük damar çapı yanı sıra …

Discussion

Tetkikine hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyonlu transfection sunulmasından bu yana daha 15 yıl önce kurulan bir yöntem olmuştur6. Enjekte birimi kardiyak çıkış aşıyor ve inferior vena kava karaciğer7transfection, yaklaşık 10-%20, bazı durumlarda tetkikine25,%2640 kadar önde gelen, sinusoids akar. Başarılı bir transfection belirleyicileri enjekte birim başına eklenen saat22…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Deutsche Krebshilfe, Almanya (grant sayıya 111289 UE), Çocuk Sağlığı (Ernest ve Amelia Gallo donatılmış doktora sonrası bursu – CTSA grant sayıya UL1 RR025744 UE) Lucile Packard Vakfı tarafından desteklenmiştir. Vektör yapıları için Dr Mark A. Kay teşekkür ediyoruz ve deneysel tavsiye ve Dr Julien Sage fareler için ve deneysel destek.

Materials

General Material
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder Thermo Fisher #SM1331 DNA ladder for electrophoresis
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583 embedding of cryo-sections
Biozym LE Agarose Biozym 840004
Ethidium bromide Sigma-Aldrich E7637-1G
D(+)-Saccharose Carl Roth 4621.1 For sweetening of the doxycyline solution
Ampicillin Sodium Salt AppliChem A0839,0010 For selection of Amp-resistant clones
LB Agar (Luria/Miller) Carl Roth X969.1
LB Broth (Luria/Miller) Carl Roth X968.1
S.O.C. Medium Thermo Fischer 15544034
Gentamicin sulfate AppliChem A1492,0001 For selection of Gentamicin-resistant clones
Roti-Histofix 4 % Fa. Roth P087.6 para-formaldehyde solution
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix invitrogen/ThermoFisher 11791-020 contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K
DB3.1 Competent Cells Thermo Fisher 11782-018
Stbl3 Chemically Competent E. coli Thermo Fisher C737303
Name Company Catalog Number Comments
Restriction Enzymes
PacI New England BioLabs R0547S
AscI New England BioLabs R0558S
FseI New England BioLabs R0588S
SacI New England BioLabs R0156S
SpeI New England BioLabs R0133S
KpnI New England BioLabs R0142S
NotI New England BioLabs R0189S
XhoI New England BioLabs R0146S
BfuAI New England BioLabs R0701S
Name Company Catalog Number Comments
Kits
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For DNA Extraction from gel
NucleoSpin Gel and PCR Clean Up Macherey & Nagel 740609.10
NucleoBond PC20 Macherey & Nagel 740571 Plasmid extraction (Mini prep)
NucleoBond PC500 Macherey & Nagel 740574 Plasmid extraction (Maxi prep)
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F530S
Name Company Catalog Number Comments
Materials for Mouse Experiments
Injekt Syringe F 1 ml Braun 9166017V For intraperitoneal injection
Omnifix Luer 3 ml Braun 4616025V For intravenous injection
Sterican Cannula 24G Braun 4657675
Sterican Cannula 27G Braun 4657705
Tamoxifen Sigma-Aldrich T5648-1G For CreER activation
Corn oil Sigma-Aldrich C8267-500ML Carrier for tamoxifen injections
Doxycycline hyclate AppliChem A2951,0025 Activation of tetracycline-dependent expression
Injekt 10 ml Syringe Braun 4606108V
Filtropur S 0.2 Sarstedt 831,826,001 For filtration of doxycycline
NaCl 0,9% Braun 3200905 Carrier for intravenous injections
Falcon Conical Tube 50ml Corning Life Science 352095
Infrared Lamp N/A N/A For warming of mouse tail
IVIS Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI.
pTC n/a Vector for constitutive gene expression, ref. 15
pEN_TTmcs Addgene #25755 Entry vector for inducible gene expression, ref. 19
pEN_TTGmiRc2 Addgene #25753 Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19
pEN_TTmiRc2 Addgene #25752 Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19
pTC ApoE-Tet Addgene #85578 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11
pTC-CMV-Tet Addgene #85577 Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
  2. Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
  3. Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
  4. Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
  5. Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
  6. Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
  7. Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
  8. Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
  9. Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
  10. Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
  11. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
  12. Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
  13. Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  15. Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
  16. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  17. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  18. Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
  19. Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
  20. Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
  21. Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
  22. Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
  23. Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
  24. Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
  25. Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
  26. Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
  27. Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
  28. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  29. Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
  30. Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
  31. Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
  32. Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
  33. Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
  34. Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
  35. Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
  36. Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
  37. Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
  38. Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
  39. Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
  40. Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
  41. Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
  42. Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
  43. Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
  44. Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
  45. Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).

Tags

In VivoGenetic ModificationMouse HepatocytesHydrodynamic Tail Vein InjectionConstitutive SystemInducible SystemCreERShRNAVector ConstructLiver ResearchLiver CancerLiver Regeneration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Hubner, E. K., Lechler, C., Rösner, T. N., Kohnke-Ertel, B., Schmid, R. M., Ehmer, U. Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection. J. Vis. Exp. (132), e56613, doi:10.3791/56613 (2018).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image