Sistemi costitutive e inducibile per la modificazione genetica In Vivo degli epatociti Mouse usando l'iniezione della vena della coda idrodinamica

L’affezione epatica cronica presenta un onere importante di salute nel mondo¹. Modelli di ricerca sugli animali sono strumenti essenziali nello studio delle malattie epatiche e hanno contribuito a rispondere alle domande complesse nella rigenerazione del fegato, infiammazione epatica e steatosi, così come il cancro del fegato². Un numero considerevole di questi modelli animali si basa sulla modificazione genetica delle cellule del fegato. Efficienti strumenti per manipolare l’espressione genica in epatociti sono pertanto utili³. Metodi consolidati come l’allevamento di ceppi di topi geneticamente o la generazione di vettori virali per l’infezione dell’epatocita sono entrambi harbor richiede tempo, problemi di sicurezza, o cedere l’espressione del transgene poveri in epatociti in vivo ^{4 , 5}. iniezione della vena della coda idrodinamica (HTVI) è un metodo alternativo per la transfezione in vivo degli epatociti che consente per l’interrogatorio di facile, veloce e conveniente di funzione del gene nel fegato. Per HTVI, un vettore contenente la sequenza di DNA desiderata è dissolto in un volume di soluzione fisiologica corrispondente al 10% del peso corporeo dell’animale iniettato. La soluzione allora è iniettata nella vena della coda entro 5-10 s⁶. Superiore a gittata cardiaca, le saline scorre dalla vena cava inferiore nelle vene del fegato, che porta all’espansione del fegato e idrodinamica transfezione di epatociti⁷. Per realizzare l’integrazione genomica stabile, il metodo è stato combinato con vettori basati su trasposone, quali il sistema di trasposone dormire bellezza. Sistemi di questo media la ricombinazione dei vettori di destinazione con i siti di ricombinazione genomica catalizzate da un sonno bellezza –transposase^8,9. Per i modelli di fibrosi del fegato o di carcinogenesi, è spesso desiderabile ai geni iperesprimere o silenzio determinati intervalli di tempo del modello di malattia. Per questo scopo, strumenti per l’espressione genica viscoelastica come Cre/LoxP-sistema o il sistema di espressione del gene tetraciclina-inducibile (Tet-On) può essere usato¹⁰.

Qui, descriviamo un protocollo per la transfezione in vivo di epatociti murini utilizzando HTVI di un sistema basato su trasposone addormentata . Oltre a un protocollo per l’espressione stabile, costitutiva di un transgene sotto il controllo di un promotore di fegato-specific, descriviamo un sistema più avanzato di vettore che unisce l’espressione costitutiva di tamoxifen-dipendente Cre ricombinasi (CreER) con la induzione dell’espressione genica di un transgene o shRNA adattato microRNA (miR-shRNA), chiamato il pTC TET-sistema¹¹. In questo sistema vettoriale, transgeni inducibile o miR-shRNA per espressione tetraciclina-dipendente vengono clonati nel vettore backbone con un sistema di clonazione recombinational, permettendo la generazione facile e veloce di nuovi vettori¹². Questa guida basate su video descrive la preparazione di opportuni vettori, iniezione e il trattamento dei topi per ottenere l’espressione del transgene/miR-shRNA viscoelastica ed infine la preparazione del tessuto del fegato per l’analisi. Il metodo descritto in questo protocollo è stato progettato per consentire la combinazione di qualsiasi sistema di topo Cre/loxP mediato con l’espressione o knock-down di qualsiasi gene di scelta, che lo rende un sistema ampiamente applicabile nella ricerca dell’affezione epatica.