Systèmes inductibles et constitutives génétique In Vivo modification des hépatocytes de souris à l’aide d’Injection dans la veine queue hydrodynamique

Hépatopathie chronique présente un fardeau de majeurs pour la santé dans le monde¹. Les modèles de recherche sur les animaux sont des outils essentiels dans l’étude des maladies du foie et ont aidé à répondre à des questions complexes dans la régénération du foie, inflammation hépatique et stéatose ainsi que le cancer du foie². Un nombre important de ces modèles animaux reposent sur la modification génétique des cellules du foie. Par conséquent, des outils efficaces pour manipuler l’expression des gènes dans les hépatocytes sont utile³. Des méthodes reconnues telles que l’élevage de lignées de souris génétiquement modifiées ou la génération de vecteurs viraux pour infection hépatocytes sont soit harbor chronophage, problèmes de sécurité, ou rendement médiocre transgene expression dans les hépatocytes en vivo ^{4 , 5}. injection dans la veine queue hydrodynamique (HTVI) est une méthode alternative pour la transfection de in vivo des hépatocytes permettant une interrogation simple, rapide et rentable de la fonction du gène dans le foie. Pour HTVI, un vecteur transportant la séquence d’ADN désirée est dissoute dans un volume de solution saline correspondant à 10 % du poids corporel de l’animal injecté. La solution est ensuite injectée dans la veine caudale dans 5-10 s⁶. Dépassant le débit cardiaque, la solution saline se jette de la veine cave inférieure dans les veines hépatiques, conduisant à l’élargissement du foie et de transfection hydrodynamique des hépatocytes⁷. Pour parvenir à une intégration génomique stable, la méthode a été combinée avec des vecteurs axée sur le transposon, tels que le système de transposon sleeping beauty. Ce système intervient dans la recombinaison des vecteurs de la cible avec les sites de recombinaison génomique catalysées par un sleeping beauty –transposase^8,9. Pour les modèles de la fibrose du foie ou de la cancérogenèse, il est souvent souhaitable d’overexpress ou du silence des gènes à certains moments du modèle de la maladie. À cette fin, des outils pour l’expression des gènes inductibles tels que le Cre/LoxP-system ou le système d’expression de gène inductible par la tétracycline (Tet-On) peut être utilisé¹⁰.

Nous décrivons ici un protocole pour la transfection de in vivo des hépatocytes murins à l’aide de HTVI d’un système transposon belle au bois dormant . Outre un protocole pour l’expression stable, constitutive d’un transgène sous le contrôle d’un promoteur spécifique du foie, les auteurs décrivent un système de vecteur plus avancé qui combine l’expression constitutive tamoxifène dépendant Cre recombinase (CreER) avec la expression inductible d’un transgène ou adaptés microARN shARN (miR-shARN), appelé le pTC TET-système¹¹. Dans ce système de vecteur, inductible transgènes ou miR-interférents pour expression dépendant de tétracycline sont clonés dans le vecteur de la colonne vertébrale avec un système de clonage de recombinaison, permettant la génération rapide et facile de nouveaux vecteurs¹². Ce guide vidéo couvre la préparation de vecteurs appropriés, injection et le traitement de souris pour atteindre l’expression de transgènes/miR-shARN inductible et enfin la préparation du tissu hépatique pour l’analyse. La méthode décrite dans le présent protocole a été conçue pour permettre la combinaison de n’importe quel système de souris Cre/loxP médiée par l’expression ou la précipitation de n’importe quel gène de choix, ce qui en fait un système largement applicable dans la recherche d’une maladie du foie.