نظم التأسيسي وإيندوسيبلي للتعديل الوراثي في فيفو من خلايا الكبد الماوس باستخدام حقن الوريد ذيل هيدرودينامية
Summary
حقن الوريد ذيل هيدرودينامية نواقل التكامل على أساس ينقول تمكن تعداء مستقرة من خلايا الكبد مورين المجراة في. نقدم هنا، بروتوكول عملي لنظم تعداء تمكن التعبير التأسيسي طويل الأجل للتحوير مفردة أو مجتمعة التعبير التأسيسي والدوكسيسيكلين إيندوسيبلي للتحوير أو مير-شرنا في الكبد.
Abstract
في نماذج أبحاث سرطان الكبد والتجدد، والالتهاب والتليف، نظم مرنة للتعبير الجيني في فيفو وإسكات مفيدة للغاية. حقن الوريد ذيل هيدرودينامية بني على أساس ينقول طريقة فعالة للتحوير الوراثي لخلايا الكبد في الفئران الكبار. وبالإضافة إلى التعبير التحوير التأسيسي، ويمكن استخدام هذا النظام لتطبيقات أكثر تقدما، مثل الجينات شرنا بوساطة تدق لأسفل، المترتبة على نظام كريسبر/Cas9 للحث على الطفرات الجينية، أو أنظمة إيندوسيبلي. هنا، يقدم مزيج التعبير كرير التأسيسي جنبا إلى جنب مع إيندوسيبلي التعبير التحوير أو مير-شرنا للاختيار كمثال لهذا الأسلوب. نحن تغطي إجراءات متعددة الخطوات بدءاً من إعداد الجمال النائم-يبني ينقول، إلى حقن وعلاج فئران، وإعداد أنسجة الكبد للتحليل قبل إيمونوستينينج. نظام عرض نهج موثوقة وفعالة لتحقيق معقدة التلاعب الجيني في خلايا الكبد. هي مفيدة على وجه الخصوص في تركيبة مع سلالات الماوس Cre/لوكسب-تعتمد ويمكن تطبيقها على مجموعة متنوعة من نماذج في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.
Introduction
ويعرض أمراض الكبد المزمنة في العالم أعباء صحية رئيسية1. نماذج حيوانية للبحث هي أدوات لا غنى عنها في دراسة أمراض الكبد، وساعدت على الإجابة على أسئلة معقدة في تجديد الكبد، والتهاب الكبد، وذلك فضلا عن سرطان الكبد2. أن عددا كبيرا من هذه النماذج الحيوانية تعتمد على التحوير الوراثي لخلايا الكبد. ومن ثم، هي أدوات فعالة التعامل مع التعبير الجيني في خلايا الكبد مفيدة3. أساليب محددة مثل تربية السلالات المهندسة وراثيا الماوس أو توليد النواقل الفيروسية للإصابة تتمثل هي الميناء تستغرق وقتاً طويلاً، أما الشواغل المتعلقة بالسلامة، أو تسفر عن التعبير التحوير الفقراء في خلايا الكبد في فيفو 4 , 5. حقن الوريد هيدرودينامية الذيل (هتفي) أسلوب بديل تعداء في الجسم الحي من خلايا الكبد مما يسمح للاستجواب سهلة وسريعة وفعالة من حيث التكلفة من وظيفة الجينات في الكبد. هتفي، يحل ناقل يحمل تسلسل الحمض النووي المطلوب في مجلد من المقابلة إلى 10% وزن الجسم الحيوان حقن المحلول الملحي. الحل ثم حقن الوريد الذيل ضمن 5-10 ق6. تتجاوز الناتج القلب، تدفقات المياه المالحة من الأجوف فينا أقل شأنا في عروق الكبد، مما أدى إلى التوسع في الكبد وتعداء الهيدروديناميكي لخلايا الكبد7. لتحقيق التكامل الجينوم مستقرة، اقترن الأسلوب ناقلات القائم على ينقول، مثل نظام ينقول النوم الجمال. هذه النظم يتوسط جزئ من ناقلات الأمراض المستهدفة مع مواقع جزئ الجينوم تحفزها8،ترانسبوساسي النوم الجمال-9. لنماذج من تليف الكبد أو التسرطن، من المستصوب غالباً للجينات أوفيريكسبريس أو الصمت في بعض النقاط الزمنية لنموذج المرض. لهذا الغرض، وأدوات للتعبير الجيني إيندوسيبلي مثل Cre/لوكسب-النظام أو نظام التعبير الجيني التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في) قد تكون تستخدم10.
هنا، نحن وصف بروتوكول في فيفو تعداء لخلايا الكبد مورين استخدام هتفي نظام قائم على أساس ينقول الجمال النائم . بالإضافة إلى وضع بروتوكول للتعبير مستقرة، والمكونة من التحوير تحت سيطرة أحد المروجين الخاصة بالكبد، يمكننا وصف نظام ناقل أكثر تقدما الذي يجمع بين تعتمد على تاموكسيفن التأسيسي لجنة المساواة العرقية recombinase (كرير) التعبير التعبير إيندوسيبلي للتحوير أو تكييفها microRNA شرنا (مير-شرنا)، دعا صوغ نظام تيت11. في هذا النظام متجه، يتم استنساخ المتسلسلات إيندوسيبلي أو مير-شرناس للتعبير تعتمد على التتراسكلين في ناقلات العمود الفقري مع وجود نظام استنساخ ريكومبيناشونال، يسمح لتوليد سريعة وسهلة ل ناقلات جديدة12. ويغطي هذا الدليل القائم على الفيديو إعداد متجهات مناسبة والحقن والعلاج من الفئران لتحقيق التعبير التحوير/مير-شرنا إيندوسيبلي، وأخيراً إعداد أنسجة الكبد للتحليل. الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يهدف إلى تمكين المزيج من أي نظام الماوس Cre/لوكسب بوساطة مع التعبير أو تدق لأسفل أي الجينات في الاختيار، مما يجعل من نظام التطبيق على نطاق واسع في البحوث المتعلقة بأمراض الكبد.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعداء لخلايا الكبد مع حقن الوريد ذيل هيدرودينامية أصبح أسلوب المنشأة منذ إطلاقها منذ أكثر من 15 عاماً6. حجم حقن يتجاوز الناتج القلب ويتدفق من الأجوف فينا أقل شأنا في الجيوب من الكبد7، مما يؤدي إلى تعداء حوالي 10-20%، وفي بعض الحالات تصل إلى 40 في المائة من خلايا الكبد<sup…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل Deutsche كريبشيلفي، ألمانيا (رقم المنحة 111289 لرق)، ولوسيل باكارد لصحة الأطفال (إرنست واميليا جالو وهبت ما بعد الدكتوراه زمالة-كتسا المنحة رقم UL1 RR025744 لرق). ونشكر الدكتور مارك أ كاي لناقلات الأمراض بنيات ودعم المشورة التجريبية والدكتور جوليان حكيم للفئران والتجريبية.
Materials
| General Material | |||
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | #SM1331 | DNA ladder for electrophoresis |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | embedding of cryo-sections |
| Biozym LE Agarose | Biozym | 840004 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637-1G | |
| D(+)-Saccharose | Carl Roth | 4621.1 | For sweetening of the doxycyline solution |
| Ampicillin Sodium Salt | AppliChem | A0839,0010 | For selection of Amp-resistant clones |
| LB Agar (Luria/Miller) | Carl Roth | X969.1 | |
| LB Broth (Luria/Miller) | Carl Roth | X968.1 | |
| S.O.C. Medium | Thermo Fischer | 15544034 | |
| Gentamicin sulfate | AppliChem | A1492,0001 | For selection of Gentamicin-resistant clones |
| Roti-Histofix 4 % | Fa. Roth | P087.6 | para-formaldehyde solution |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | |
| GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix | invitrogen/ThermoFisher | 11791-020 | contains LR-clonase enzyme mix II and proteinase K |
| DB3.1 Competent Cells | Thermo Fisher | 11782-018 | |
| Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher | C737303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction Enzymes | |||
| PacI | New England BioLabs | R0547S | |
| AscI | New England BioLabs | R0558S | |
| FseI | New England BioLabs | R0588S | |
| SacI | New England BioLabs | R0156S | |
| SpeI | New England BioLabs | R0133S | |
| KpnI | New England BioLabs | R0142S | |
| NotI | New England BioLabs | R0189S | |
| XhoI | New England BioLabs | R0146S | |
| BfuAI | New England BioLabs | R0701S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits | |||
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For DNA Extraction from gel |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean Up | Macherey & Nagel | 740609.10 | |
| NucleoBond PC20 | Macherey & Nagel | 740571 | Plasmid extraction (Mini prep) |
| NucleoBond PC500 | Macherey & Nagel | 740574 | Plasmid extraction (Maxi prep) |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F530S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for Mouse Experiments | |||
| Injekt Syringe F 1 ml | Braun | 9166017V | For intraperitoneal injection |
| Omnifix Luer 3 ml | Braun | 4616025V | For intravenous injection |
| Sterican Cannula 24G | Braun | 4657675 | |
| Sterican Cannula 27G | Braun | 4657705 | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | For CreER activation |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | Carrier for tamoxifen injections |
| Doxycycline hyclate | AppliChem | A2951,0025 | Activation of tetracycline-dependent expression |
| Injekt 10 ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Filtropur S 0.2 | Sarstedt | 831,826,001 | For filtration of doxycycline |
| NaCl 0,9% | Braun | 3200905 | Carrier for intravenous injections |
| Falcon Conical Tube 50ml | Corning Life Science | 352095 | |
| Infrared Lamp | N/A | N/A | For warming of mouse tail |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | In vivo imaging system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids for cloning of sleeping beauty-transposon vectors for HTVI. | |||
| pTC | n/a | Vector for constitutive gene expression, ref. 15 | |
| pEN_TTmcs | Addgene #25755 | Entry vector for inducible gene expression, ref. 19 | |
| pEN_TTGmiRc2 | Addgene #25753 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression with co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pEN_TTmiRc2 | Addgene #25752 | Entry vector for inducible miR-shRNA expression without co-expression of GFP, ref. 19 | |
| pTC ApoE-Tet | Addgene #85578 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with ApoE.HCR.hAAT promotor, ref. 11 | |
| pTC-CMV-Tet | Addgene #85577 | Expression vector for inducible gene or miR-shRNA expression with CMV promotor, ref. 11 |
Referencias
- Byass, P. The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health. BMC Med. 12, 159 (2014).
- Liu, Y., et al. Animal models of chronic liver diseases. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).
- Dow, L. E., et al. Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice. PLoS One. 9 (4), e95236 (2014).
- Lundstrom, K. Latest development in viral vectors for gene therapy. Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Kanefuji, T., et al. Hemodynamics of a hydrodynamic injection. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029 (2014).
- Ivics, Z., Izsvak, Z. Sleeping Beauty Transposition. Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).
- Hausl, M. A., et al. Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B. Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).
- Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease. Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. 19 (1-2), (2017).
- Katzen, F. Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).
- Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. Specific primer design for the polymerase chain reaction. Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Ehmer, U., et al. Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo. Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
- Koontz, L. Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work. Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).
- Shin, K. J., et al. A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).
- Hubner, E. K., et al. An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes. J Gene Med. , (2016).
- Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. Site-directed transposon integration in human cells. Nucleic Acids Res. 35 (7), e50 (2007).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).
- Maruyama, H., et al. High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection. J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).
- Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery. Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).
- Brunetti-Pierri, N., Lee, B. Gene therapy for inborn errors of liver metabolism. Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).
- Atta, H. M. Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials. World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).
- Malato, Y., et al. Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration. J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).
- Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
- Viecelli, H. M., et al. Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver. Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).
- Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice. Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).
- Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates. J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).
- Koponen, J. K., et al. Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo. Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).
- Saitoh, Y., et al. Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space. Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).
- Yao, M., et al. Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity. PLoS One. 11 (3), e0150894 (2016).
- Santacatterina, F., et al. Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state. Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).
- Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea. Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).
- Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model. J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).
- Yuan, L., et al. An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice. Exp Anim. , (2016).
- Zhou, Q., et al. RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model. Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936 (2015).
- Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration. Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).
- Tordella, L., et al. SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer. Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).
- Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping. J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).
- Vercellotti, G. M., et al. H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice. Front Pharmacol. 5, 79 (2014).
- Ando, M., et al. Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023 (2014).
- Watcharanurak, K., et al. Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice. Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).
