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Medicina

Efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol

Published: November 10, 2017
doi:
10.3791/56596
, , , , , , ,
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories,Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry,University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

Summary

El objetivo de este estudio fue evaluar en vitro hipolipemiantes efectos de la droga en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol. Comparación de fármacos hipolipemiantes reveló variaciones en su efecto en la modulación de las características morfológicas de las partículas de colesterol.

Abstract

Tratamiento de la dislipemia pacientes con fármacos hipolipemiantes conduce a una reducción significativa en el nivel de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y un bajo a moderado nivel de aumento en el colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL) en plasma. Sin embargo, un posible papel de estos fármacos en la alteración de la morfología y distribución de las partículas de colesterol es mal entendido. Aquí, describimos la evaluación en vitro de los efectos de drogas hipolipemiantes en la modulación de las características morfológicas de las partículas de colesterol con el método de matriz de la placa en combinación con imágenes de citometría de flujo. Análisis de imagen de las partículas de colesterol indican que atorvastatina, lovastatina, simvastatina y ezetimiba inducen la formación de partículas en forma de filamento globulares y lineales, mientras que la niacina, fibratos, fluvastatina y rosuvastatina inducen el formación de partículas sólo con forma globular. Próxima, muy purificada lipoproteína de baja densidad (VLDL) y las partículas de LDL incubadas con estos fármacos demostraron cambios en la morfología y la imagen de textura de colesterol subpoblaciones de partículas. Además, la investigación de 50 muestras de suero reveló la presencia de un mayor nivel de partículas de colesterol HDL en forma lineales en sujetos con dislipidemia (media de 18,3%) en comparación con las muestras normales de edad comparable (media de 11,1%). También se observaron variaciones considerables en los efectos de drogas hipolipemiantes en la reducción lineal en forma de formación de partículas de colesterol LDL y HDL en muestras de suero. Estos resultados indican que los fármacos hipolipemiantes, además de sus efectos hipolipidémicos mediada por células, pueden modular directamente morfología de partículas de colesterol por un mecanismo no enzimático de acción. Los resultados de estos resultados tienen potencial para informar el diagnóstico de la ateroesclerosis y predecir óptima terapia hipolipemiante.

Introduction

Numerosos estudios clínicos han demostrado efectos beneficiosos de los fármacos hipolipemiantes en la reducción de niveles plasmáticos de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) y un bajo a moderado nivel de aumento en el colesterol de lipoproteína de alta densidad (HDL), que evita incidencias tanto primarias como secundarias de eventos cardiovasculares adversos relacionados con la aterosclerosis1,2,3,4,5. Estatinas, un grupo de inhibidores de HMG-CoA reductasa enzima, bloquean la síntesis de colesterol endógeno en el hígado que en turno pueda bajar circulando los niveles de colesterol LDL en la sangre6,7. Asimismo, el hipolipemiante de efecto de la niacina es mediada por su inhibición no competitiva y directa del hepatocito diacilglicerol Aciltransferasa-2, una enzima hepática clave involucrados en la síntesis de triglicéridos8. Comparativamente, ezetimiba reduce el nivel de plasma de LDL al limitar la absorción de colesterol exógeno por Unión a proteína de Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) localizada en las células epiteliales del intestino delgado9. Fenofibrato, otro fármaco hipolipemiante, reduce las concentraciones plasmáticas de triglicéridos y también moderado disminuye el colesterol LDL a través de receptores proliferator-activado peroxisome vía10. Además, ácido graso omega-3 se divulga para tener el efecto anti-aterosclerótico debido a su capacidad para reducir los niveles plasmáticos de LDL11.

Los medicamentos reductores de lípidos, además de su efecto primario sobre bajar el LDL colesterol, tienen una serie de efectos pleiotrópicos beneficiosos como mejorar el nivel de HDL, mejorando funciones endoteliales, reducción de la inflamación e inhibición plaquetaria agregados12,13,14. Sin embargo, el mecanismo subyacente de estos fármacos en el aumento de las partículas de colesterol HDL y modificar sus características estructurales no se entienden completamente. Ya que estos medicamentos son prescritos ampliamente para tratar la aterosclerosis relacionada con las enfermedades cardiovasculares (ECV), es esencial para investigar su posible papel en la determinación de las características morfológicas y la distribución de las partículas de lípidos. El lipidome plasma humano consta de aproximadamente 600 distintos lípidos y 22 tipos moleculares de colesterol que se encuentran en varios tamaños, formas, densidades y composiciones15,16,17 . Métodos analíticos como la ultra centrifugación, NMR y electroforesis del gel del gradiente son utilizados para caracterizar las partículas LDL y HDL y sus subfracciones18,19. Sin embargo, la aplicación de estos métodos se limita a estudios tendientes a determinar el efecto de las drogas en la modulación de morfología y ensamblaje de las partículas de lípidos. El conjunto de placa base de citómetro de flujo es un análisis bioquímico funcional desarrollado para la detección y visualización de suero había derivado lipídico y amiloide placa partículas20. Las ventajas de en vitro método descrito en este estudio de imagen permiten identificación de lípidos moduladores drogas efectos en la alteración de la morfología y distribución de las partículas de colesterol en muestras de suero y buffer.

Protocol

1. preparación de fluorescente etiquetado colesterol y fármacos hipolipemiantes Nota: agregados de colesterol marcado con fluorescente y estatinas se prepararon según lo descrito en nuestro artículo anterior 21. para detalles de los reactivos, imágenes citómetro de flujo, analizadores de química y software de análisis de datos utilizados en este estudio, véase Tabla de materiales. Solubilizar colesterol liofilizado marcado con fluorescente (1 mg, Ex / Em = 495 nm/507 nm) en polvo en 1 mL de alcohol al 100%. Centrifugar la muestra durante 3 min a 2.040 x g y utilice el sobrenadante que contiene agregados solubles colesterol marcado con fluorescencia en el ensayo de placa matriz. Para la preparación de medicamentos, solubilizar individualmente los polvos (2 mg) de simvastatina, lovastatina, atorvastatina, ezetimiba y ácidos grasos de omega-3 en 1 ml de alcohol al 100%. Después de la centrifugación durante 3 min a 2.040 x g, usar el sobrenadante que contiene drogas en el análisis. Asimismo, solubilizar individualmente los polvos (2 mg) de fluvastatina, rosuvastatina, niacina y fibrato en 1 mL de agua desionizada para hacer una solución de 2 mg/mL. Después de la centrifugación durante 3 min a 2.040 x g, usar el sobrenadante que contiene drogas en el análisis de matriz de la placa. 2. Placa matriz de análisis para la formación de partículas de examen In Vitro de colesterol analizador de la química de uso-1 (véase tabla de materiales) para configurar el análisis de la matriz de placa para la formación de partículas de colesterol. Realizar el ensayo en un fondo redondo, placa de 96 pocillos de enlace de baja proteína utilizando los reactivos preparados en la sección 1. Mantener el volumen de reacción final en cada pozo a 200 μl y realizar todos los ensayos por triplicado. Primero, carga 194.5 μl de fosfato tampón salino (PBS) a cada pocillo. a cada uno, añadir 2,5 μl (5 μg) de cada solución de drogas hipolipemiantes y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química para mezclar uniformemente el medicamento en solución. Ningún fármaco se añade a las muestras control negativo. Por último, 2 μl (2 μg) colesterol marcado con fluorescente agregada la solución en cada pocillo y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química. Incube la placa en un agitador de laboratorio durante 2 h a 37 ° C y 200 rpm. Después de la incubación, adquirir las imágenes de partículas por citometría de imagen. 3. Captura imágenes de colesterol partículas usando proyección de imagen citometría de flujo abrir la plantilla de adquisición de datos para cargar la configuración correcta del instrumento. Haga clic en " archivo ", seleccione " plantilla abierta … " y seleccione el archivo de plantilla. Haga clic en " ras, cerradura, carga " para preparar el instrumento para la carga de la muestra. Cuando la " muestra la carga " se abre la caja de diálogo, haga clic en " OK " cargar 50 μl de las muestras de cada uno bien preparado en la sección 2 en el citómetro de flujo imagen. Haga clic " Run | Configuración " para ver las partículas en el área de proyección de imagen en tiempo real. Cuando las partículas en el área de proyección de imagen son en buen foco, haga clic en " ejecutar | Adquirir " para adquirir imágenes de cada objeto al mismo tiempo en forma de alto rendimiento para campo oscuro (lado dispersión/SSC), campo claro (BF), fluorescencia verde y fluorescencia amarillo. Repita los pasos 3.2-3.5 para adquirir 5.000-10.000 partículas de cada muestra de. Analizar todos los archivos de imagen raw utilizando el software de análisis de imagen para determinar la intensidad de la fluorescencia de objeto y variaciones morfológicas. Haz clic en el " herramientas " botón en la parte superior del software de análisis de imagen, a continuación, seleccione " archivos de datos por lotes " en el menú desplegable, que se abrirá la " lotes " ventana. En el " lotes " ventana, haga clic en el " añadir lote " botón, que abrirá sus puertas el " definir un lote " ventana. En el " definir un lote " ventana, haga clic en la " agregar archivos " el botón y seleccione los archivos de imagen raw, haga clic en la " plantilla " botón y seleccione el archivo de plantilla de análisis de los datos pertinentes y luego " OK " y " enviar lotes " para iniciar el procesamiento y análisis de los archivos de imagen raw. 4. Placa matriz análisis basado en evaluación de hipolipemiantes fármacos efecto sobre las partículas de colesterol purificado como se describe en el paso 2.1, realiza el ensayo de formación de partículas de colesterol purificado VLDL, LDL y HDL lipoproteínas/partículas. Realizar el análisis de matriz de la placa en una placa de 96 pozos. Primero, cargar todos los pocillos con PBS; utilizar un volumen final de 200 μL de cada pocillo. Para el control negativo, añadir 4 μg de VLDL, LDL, o las proteínas/las partículas de HDL individualmente en cada uno así sin drogas y agitar la placa por 30 s. Para examinar el efecto de drogas hipolipemiantes, agregar 4 μg de VLDL, LDL, o las proteínas/las partículas de HDL individualmente a cada uno bien y agitar la placa por 30 s. Para pozos con 4 μg VLDL, LDL y HDL, 2,5 μl (5 μg) ezetimiba, lovastatina, simvastatina y niacina solución y agitar la placa por 30 s, colocando en el analizador de la química-1. Por último, 2 μl (2 μg) colesterol marcado con fluorescencia agregada la solución a todos los pozos y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química. Incube la placa durante 2 h en un agitador de laboratorio a 37 ° C y 200 rpm. Adquirir las muestras mediante citometría de flujo imágenes siguiendo pasos 3.1-3.5. Analizar los archivos de imagen raw utilizando el software de análisis de imagen como se describe en el paso 3.7. En la plantilla de análisis, utilice el siguiente esquema bloquea para la identificación de subpoblaciones de partículas de colesterol. En una parcela de la cantidad de píxeles de canal verde saturado (eje x) y campo oscuro canal número de píxeles saturados (eje y), rechazar objetos con uno o más píxeles saturados en ningún canal. Parcela las partículas de los objetos sin pixeles saturados con intensidad de canal verde (eje x) y la intensidad SSC (eje y): los objetos caen en una de tres regiones (VLDL, LDL, HDL) basadas en su canal verde e intensidades SSC. Nota: Estas puertas fueron creadas en base a datos generados a partir de experimentos de control llevado a cabo utilizando purificada VLDL, LDL y HDL partículas/proteínas sin la droga. Para determinar el efecto de drogas hipolipemiantes para cada muestra, calcular las concentraciones de partículas de lipoproteína total, así como el porcentaje de cada subpoblación (VLDL, LDL, HDL) como se describe en paso 6.5. Las concentraciones calcular las partículas (partículas/mL) utilizando la siguiente ecuación: Nota: la VLDL, LDL y HDL gating regiones en el diagrama de punto de fluorescencia detectar ~ 80% de sus subpoblaciones respectivas y el resto de ~ 20% de las partículas se superponen con otras regiones bloquea. 5. Medición de las concentraciones de lípidos en las muestras de suero para la determinación de las concentraciones de LDL, HDL, colesterol y triglicéridos por el analizador de la química-2, utilizar muestras de suero obtenidas de sujetos normales y dislipidemia pareados por edad. Definir anormal concentración de LDL, HDL, colesterol y triglicéridos en su concentración identificado más allá de los valores de referencia superior e inferior en las muestras de suero base. Seguir la recomendaciones de valor de referencia normalDED por el fabricante del reactivo: colesterol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4-100 mg/dL) y triglicéridos (9-200 mg/dL). Identificar las muestras de suero que tienen un valor anormal por debajo del valor de referencia inferior o por encima de la referencia de mayor valor para el colesterol y los triglicéridos y utilizarlas para proyección en presencia y en ausencia de fármacos hipolipemiantes. 6. Analizar el efecto de drogas en la formación de partículas de colesterol en muestras de suero uso la química analizador-1 para configurar el análisis de la matriz de placa para la formación de partículas de colesterol en muestras de suero. Realizar el ensayo en un fondo redondo, placa de 96 pocillos de enlace de baja proteína. Utilizar un volumen de reacción final de 200 μL/pocillo y realizar todos los ensayos por triplicado. Preparar la placa por la carga de reactivos en una manera paso a paso. Preparar los pocillos control. Carga 193 μl de PBS a cada pocillo. Añadir 2.5% (v/v) suero (muestra de sola suero por pozo) y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa de reacción del analizador de la química. Añadir 2 μl (2 μg) de colesterol marcado con fluorescencia total solución en cada pocillo y agitar la placa por 30 s, colocando en una placa del analizador-1 reacción química. Preparar los pozos con drogas. Carga 191 μl de PBS a cada pocillo. Añadir 2.5% (v/v) suero (muestra de sola suero por pozo) y agitar la placa por 30 s, colocando en una placa del analizador-1 reacción química. Añadir 2 μl ezetimiba, simvastatina y lovastatina, niacina solución (4 μg) a excepción de los pozos de control negativo. Añadir sólo un medicamento por pozo y agitar la placa por 30 s, colocando en una placa del analizador-1 reacción química. Añadir 2 μl de colesterol marcado con fluorescencia agregada solución (2 μg) en cada pocillo y agitar la placa por 30 s, colocando en la placa del analizador-1 reacción química. Cargar medicamentos solamente después de todos los pozos (control y tratados con drogas) han sido cargados con sus respectivos sueros y añadir colesterol marcado con fluorescencia en el final de este paso. Incube la placa durante 2 h en un agitador de laboratorio a 37 ° C y 200 rpm. Adquirir las muestras por proyección de imagen citómetro de flujo siguiendo los ajustes descritos en los pasos 3.1-3.6. Usar la imagen de análisis de software para todos los archivos de imagen utilizando la misma plantilla como se describe en pasos 3.7 de procesamiento por lotes. Realizar el análisis de datos mediante la elaboración de puertas en la parcela como se describe en los pasos 4.5 y 4.6. Para determinar la disminución de lípidos drogas efecto y respuesta (baja, moderada y alta) para cada muestra, calcular la concentración de partículas de lipoproteína total, así como el porcentaje de partículas totales que comprende de VLDL, LDL y HDL subpoblaciones. Trazar las poblaciones de VLDL, LDL y HDL en un histograma del objeto ' s campo brillante imagen, anchura restada de la longitud (longitud – anchura) y la puerta en las regiones ya sea globulares o lineales: objetos (longitud – anchura) ≤ μm 2 caen en el región globular para calcular el porcentaje de globular y lineal en forma de partículas. Comparar el porcentaje de globulares y lineales en forma de LDL y HDL colesterol partículas identificadas para cada muestra de suero incubado con y sin cada droga. Entre obtenidas por triplicado para cada muestra de suero, aceptar el porcentaje de lineal y globulares en forma de partículas de LDL y de HDL que caen dentro del rango de ±2 SD para determinación del efecto de drogas.

Representative Results

Placa matriz análisis basado en el análisis de los efectos de drogas hipolipemiantes en la formación de partículas de colesterol: Para evaluar el efecto de statins en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol, agregados de colesterol marcado con fluorescente individual se incubaron con lovastatina, simvastatina, atorvastatina, rosuvastatina y fluvastatina en el búfer. Todas estas muestras fueron adquiridas mediante citometría de flujo imágenes para capturar imágenes de las partículas de colesterol para el análisis de la morfología como se muestra en la figura 1 y figura 2. Curiosamente, analizando el efecto de drogas en la formación de partículas de colesterol en buffer indica que lovastatina, simvastatina y atorvastatina inducen la formación de una población heterogénea de partículas de colesterol muestra diversos tamaños y formas, Figura 3a -c. Por el contrario, las partículas de colesterol se forman en presencia de rosuvastatina, fluvastatina, y el control negativo (sin drogas) fueron homogéneos en la forma y morfología, como se muestra en la Figura 3d-f. Además, se observó que lovastatina, simvastatina y atorvastatina inducida por la formación de partículas de colesterol exhibiendo ambas morfologías globulares y lineal del filamento, mientras que la rosuvastatina y fluvastatina inducida por la formación de colesterol partículas con sólo morfología globular. El efecto de statins en inducir la formación de cadenas lineales se encontró en la orden de 16% para lovastatina, 2% para la simvastatina y 0.2% para atorvastatina. Para evaluar el efecto de fármacos hipolipemiantes en la formación de partículas, agregados de colesterol marcado con fluorescente individual se incubaron con ezetimiba, fibrato, niacina y ácido graso omega-3. Como se observa con las estatinas, estos fármacos inducida por la formación de partículas de colesterol con tamaños heterogéneos y como se muestra en la figura 4a-d. Entre ellos, ezetimibe indujo la formación de partículas de colesterol exhibiendo ambas morfologías globulares y lineal del filamento mientras que fibrato, niacina y ácido graso omega-3 inducida por la formación de partículas de colesterol sólo en forma globular. Por consiguiente, el efecto de los medicamentos en la cadena lineal en forma de formación de partículas de colesterol fue orden del 3% para ezetimibe, 0% para fibrato, 0% para la niacina y 0% para el ácido graso omega-3. El análisis morfológico reveló cada filamento globular o lineal en forma de colesterol partícula se compone de muchas pequeñas partículas Unidas entre sí. Los tamaños de partículas de colesterol globular positivas fluorescentes identificados están en la gama de ~ 2-30 μm2, mientras que los tamaños de las partículas en forma lineales en el rango de ~ 2 a 60 μm2. Analizar el efecto de fármacos hipolipemiantes en partículas LDL y VLDL purificada: Para examinar más lejos la formación de partículas de colesterol en presencia de las lipoproteínas, los agregados de colesterol marcado con fluorescente individualmente se incubaron con purificado proteínas/partículas VLDL, LDL y HDL. Los resultados mostraron, en comparación con la incubación con las partículas LDL y HDL, que incuban los agregados de colesterol con proteínas VLDL causadas la formación de un mayor número de partículas de colesterol, figura 5. Además, dos principales fracciones de partículas de colesterol fueron observados en poblaciones de VLDL, lo que sugiere su transformación parcial en una fracción de LDL durante la incubación con los agregados de colesterol marcado con fluorescente. El análisis de imágenes de partículas indicó la presencia de globular (~ 97%) y partículas de (~ 3%) en forma lineales entre las poblaciones de VLDL, LDL y HDL. Los rangos de tamaño de partículas globulares son ~ 2-30 μm2, mientras que los rangos de tamaño de partículas lineales son ~ 2-60 μm2. Para examinar el efecto de drogas hipolipemiantes en las partículas purificadas, las partículas de VLDL y LDL se incubaron individualmente con ezetimiba, lovastatina, simvastatina y niacina. Como resultado, en comparación con experimentos de control sin la droga, el efecto de drogas en la formación de partículas de VLDL fue mayor en niacina, ezetimibe, simvastatina y lovastatina. Las partículas de LDL incubadas con la droga demostraron una importante fracción única y el efecto de droga-inducida en la formación de partículas fue mayor en ezetimibe, simvastatina, lovastatina y ácido nicotínico, figura 6. Variaciones de los efectos de drogas hipolipemiantes en la alteración de la distribución de las partículas de colesterol en muestras de suero: Los experimentos anteriores se realizaron en la solución tampón con lipoproteínas purificadas para evaluar el efecto de la droga. Por lo tanto, en el siguiente paso, la eficacia de fármacos hipolipemiantes en la formación de partículas de colesterol fue examinada usando 50 muestras de suero recogidas de 25 sujetos con dislipidemia y 25 sujetos normales de edad comparable. La respuesta de la droga en cada muestra del suero se midió en base a cambios en el perfil de formación de partículas de colesterol en presencia y en ausencia de drogas. En el ensayo de placa matriz, cada muestra de suero se proyectó contra el ezetimibe, lovastatina, simvastatina y niacina drogas. Los resultados revelaron diferencias entre estos medicamentos en la modulación de la distribución de las partículas VLDL, LDL y HDL en muestras de suero, particularmente su efecto en reducir LDL y aumentar la formación de partículas de colesterol de HDL. Tres representantes de las muestras de suero de dislipidemia que única respuesta a los fármacos hipolipemiantes se muestran en la figura 7. Identificación del efecto de drogas sobre morfología modulación de suero había derivado de partículas de colesterol HDL y LDL: El análisis del fenotipo de las partículas de colesterol derivados del suero reveló la presencia de filamentos lineales y globulares en forma VLDL, LDL, y subpoblaciones de HDL, lo que confirma una morfología similar identificada en los experimentos realizaron tanto en el buffer y con partículas de lipoproteína purificada como se muestra en la figura 8. Sin embargo, la distribución de las subpoblaciones de las partículas de colesterol de forma globular y lineales varió ampliamente entre dislipemia y sujetos normales de edad comparable. En particular, los ensayos de control realizados sin las drogas mostraron diferencias en la distribución de cadena lineal en forma de partículas de colesterol LDL entre dislipemia (media de 2.0%) y a normales pareados por edad (media de 1.3%) muestras de suero. Del mismo modo, un mayor nivel de cadena lineal en forma de partículas de HDL colesterol se observó en muestras de dislipidemia (media de 18,3%) en comparación con la edad comparable las muestras de suero (media de 11,1%). En correlación, el análisis se realizan en presencia de drogas en muestras de suero de dislipemia mostró una reducción significativa en lineal forma HDL colesterol partículas formación para simvastatina (media de 8,3%), ezetimiba (media de 11,5%), lovastatina (media de 11.7%), y no hay reducción para la niacina (media de 18,3%). Además, se observó una disminución en la formación de partículas de colesterol de LDL en forma lineales en muestras de suero de dislipemia cuando se incuban con las drogas mostradas en la tabla 1. Además, los análisis realizados en presencia de drogas en samp de edad comparable del control sueroles mostraron reducción significativa en la forma de las partículas de colesterol de HDL en simvastatina (media de 5,0%), ezetimiba (promedio de 8.2%), lovastatina (promedio 8,7%) y niacina (media 10.8%) como se muestra en la tabla 2. Dislipemia y suero normal pareados por edad muestras exponiendo la reducción inducida por drogas en el lineal en forma de LDL y HDL colesterol partículas mostraron un aumento relativo en las partículas de colesterol de forma globular (datos no mostrados). Figura 1: Esquema que ilustra el proceso de visualización en vitro de la morfología de las partículas de colesterol. (a, b) La adición de drogas hipolipemiantes en las muestras de suero o buffer. (c) la adición de colesterol soluble marcados con fluorescencia agregados a las muestras. (d) adquirir las muestras resultantes para el análisis morfológico de partículas de colesterol insoluble mediante citometría de flujo de imágenes. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: identificación de dos morfologías distintas de partículas de colesterol mediante citometría de flujo imagen. (a) las partículas se segregan en las poblaciones globulares o lineales basadas en el análisis textural de las imágenes de campo claro. En concreto, la trama de punto significa homogeneidad H (eje x) y significa entropía H (eje y) contiene dos regiones cerradas para detectar globular (rojo) y cadena lineal en forma de partículas de colesterol (azul). (b) imágenes mostrando la morfología de las partículas en forma globulares identificado en la población 1. Imágenes (c) de cadena lineal en forma de partículas identificadas en la población 2. (d) histograma muestra la distribución de las partículas de colesterol positivo fluorescente utilizado para determinar su concentración y subpoblaciones. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: muestra el efecto de statins en la modulación de la formación de partículas de colesterol de galerías de imágenes. Campo brillante se refiere a la zona similar al FSC en el citómetro de flujo convencional. Canal verde se refiere a la emisión de la fluorescencia detectada en el 505-560 nm y amarillo canal se refiere a la emisión de la fluorescencia detectada en el 560-595 nm. (a-e) Galerías de imágenes mostrando la morfología de las partículas de colesterol se forman en presencia de lovastatina, simvastatina, atorvastatina, rosuvastatina y fluvastatina, respectivamente. (f) formación de partículas de colesterol en la ausencia de estatinas (control negativo). Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: demostrar el efecto diferencial de los fármacos hipolipemiantes en la modulación de la formación de partículas de colesterol. (a-d) Galerías de imágenes mostrando la morfología de las partículas de colesterol se forman en presencia de ezetimiba y fibrato, la niacina, ácido graso omega-3, respectivamente. Canal verde se refiere a la emisión de la fluorescencia detectada en el 505-560 nm y amarillo canal se refiere a la emisión de la fluorescencia detectada en el 560-595 nm. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Análisis de VLDL, LDL y HDL colesterol partículas formación en ausencia de medicamentos. DOT-plots: Eje x muestra un espectro de partículas de colesterol en el canal de fluorescencia verde (505-560 nm) y eje y dispersión lateral. Gating presenta regiones de partículas VLDL, LDL y HDL en las fluorescencia dot-plots. (a) formación de partículas de colesterol en presencia de VLDL purificada. (b) representante de imágenes de partículas de VLDL. (c) formación de partículas de colesterol en presencia de LDL purificado. (d) representante de imágenes de partículas de LDL. (e) formación de partículas de colesterol en presencia de HDL purificada. imágenes (f) representante de las partículas de HDL. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: demostrar el efecto de los fármacos hipolipemiantes en purificado partículas de colesterol VLDL y LDL. (un) VLDL partículas sin la droga. (b) VLDL partículas incuban con ezetimibe. (c) VLDL partículas incuban con lovastatin. las partículas (d) VLDL incuban con simvastatina. (e) VLDL partículas incuban con niacina. (f) LDL partículas incuban sin la droga. partículas (g) LDL incuban con ezetimibe. partículas (h) LDL incuban con lovastatina. las partículas () LDL incuban con simvastatina. partículas (j) LDL incuban con ácido nicotínico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: fluorescencia dot-plots mostrando un efecto diferencial de los fármacos en la modulación de la formación de las partículas VLDL, LDL y HDL colesterol en muestras de suero hipolipemiantes. Fila superior, detección de suero 1 mostrando bajo nivel drogas respuesta creciente 0 a 15% formación de partículas de HDL; fila del medio, la proyección de respuesta de nivel moderado de drogas suero 2 mostrando en el aumento de 16 a 50% de partículas de HDL; Fila inferior, proyección de suero 3 mostrando mayor nivel drogas respuesta en el aumento de 51 a 100% las partículas de HDL. (a, f, k) Muestras de suero sin drogas. (b, g, l) Las muestras de suero incuban con ezetimibe. (c, h, m) Las muestras de suero incuban con lovastatin. (d, e, n) Las muestras de suero se incuban con simvastatina. (j, e, o) Las muestras de suero incuban con niacina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: galerías de imágenes mostrando la morfología de las partículas de colesterol en suero de la muestra 1. Canal verde muestra imágenes de la emisión de fluorescencia de las partículas; dispersión lateral (canal cian) muestra imágenes excitación del laser de la luz dispersada por las partículas. (un) colesterol en forma Globular y lineal partículas forman sin la droga. (b, c, d, e) Las partículas de colesterol se forman en presencia de ezetimibe, lovastatina, simvastatina y niacina, respectivamente. Barras de escala= 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. ID de suero Sin drogas (Control) Con ezetimiba Con lovastatina Con simvastatina Con niacina % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % DNP-01 1.73 45.2 0.81 18.1 0,61 16.1 0,59 13.9 2.26 33.6 DNP-02 2.86 35.9 1.26 30.9 1.27 22.7 0.73 15.2 3.03 37.7 DNP-03 2.04 35.8 0.87 4,82 1.02 4.14 0.36 3.06 0.45 9.57 DNP-04 2.56 32.9 1.15 21.8 1.12 18.6 0.77 17.2 3.37 36.5 DNP-05 0.42 29.2 0.24 5,62 0.22 8.72 0.16 9,91 0.35 22.2 DNP-06 1.8 28.1 0.4 16.8 0.62 15 0.42 9.27 2.28 38.4 DNP-07 1.8 26.5 0.85 10.5 1.18 19.9 0.62 7.32 1.29 23.4 DNP-08 0.98 22.8 0.86 7.28 1.55 10.2 0.14 5.98 0,59 13.3 DNP-09 3.87 22.1 1.98 9.56 1,87 10.3 1.46 7,96 2.86 9.88 DNP-10 4.46 21.9 2.57 13.6 4.04 17.1 2.28 11.9 0.71 25.7 DNP-11 1.57 19.2 1.15 9.24 1.37 6,98 0.74 5.03 1.37 16 DNP-12 1.06 16.7 0.66 4.38 0,7 4.74 0.99 6,36 1.14 4,73 DNP-13 4.85 16.6 1.28 30.4 1.4 32.6 0,8 16.6 4.02 31 DNP-14 2.08 16 0,68 15.4 0,64 16.5 1.97 10.2 1.25 20.11 DNP-15 1.5 11.9 1.14 13.3 1.21 11.4 0,8 6.12 1.38 4,59 DNP-16 1.82 10.4 2.04 9.59 1.24 5,62 0.91 5,38 1.31 7.61 DNP-17 1.05 10.3 1.02 4.7 1.78 15.1 0,93 7.81 1.27 13 DNP-18 1.11 8.76 0.54 3.68 0,61 3.51 1.01 5.03 1.02 6.69 DNP-19 1 8.52 0.75 6.67 0,76 5.86 0.91 8.36 1.22 11.9 DNP-20 3.54 7.92 3.78 12 3.56 5,81 3.28 8.28 3.44 12.3 DNP-21 1,88 7.69 2.12 11.4 1.73 9.54 1.77 8.34 2.32 16.7 DNP-22 1.64 7.17 0.35 5.75 0,56 13.2 0.14 4.33 1.23 17.8 DNP-23 1.54 6.27 1.25 7.24 1.02 6.12 0.73 3.58 1.42 6.69 DNP-24 0.53 6.22 0,52 4.49 0.91 5.57 0.54 4.01 0.65 10.5 DNP-25 2.97 5.1 1.59 11 1,88 9 1.03 6.54 2,61 29.1 Tabla 1: detección de dislipidemia las muestras de suero en el ensayo de placa matriz muestran el efecto diferencial de fármacos hipolipemiantes. En comparación con los controles sin drogas (columnas 2, 3), las muestras de suero incuban con ezetimiba (columnas 4, 5), lovastatina (columnas 6, 7), simvastatina (columnas 8, 9) y niacina (columnas 10, 11) mostró variaciones de inducción lineal-en forma de LDL y HDL colesterol formación de partículas. ID de suero Sin drogas Con ezetimiba Con lovastatina Con simvastatina Con niacina % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % % Lineales, partículas de LDL Partículas de HDL lineales % PNAN-01 2.05 26.8 0.62 11.9 0,56 16.9 0,52 9.28 1.4 11.9 PNAN-02 1.35 26.3 1.68 21.8 2.59 23.6 0,79 6.92 2.16 29.7 PNAN-03 2.4 24.9 0.53 7.54 0.57 13.8 0.55 5,82 1.7 4,71 PNAN-04 1.99 21.5 1.54 9,45 1.56 8.25 0.31 3.74 2.88 20.8 PNAN-05 1.77 18.8 1.49 6.03 1.65 5.5 0.54 4.67 1.2 8.19 PNAN-06 1.12 15.2 0.67 4.42 2.68 13.3 0.5 2.37 1.54 16.3 PNAN-07 1.03 14.4 0,79 6.83 1.45 7.91 0.67 5,36 1.57 12 PNAN-08 0.98 14.3 0.88 4.48 2 7.1 0.19 2,66 1.02 18.1 PNAN-09 2.85 14.1 1.95 12.6 2.34 12.5 0,7 6.24 1.84 18.7 PNAN10 1.01 10.4 0,8 5,07 0.51 5.9 0.87 6.5 1.63 10.9 PNAN-11 0,92 12.4 0.21 9.94 0.29 3.31 0.29 6.52 0.58 10.4 PNAN-12 0.6 10.5 0,56 5,78 1.06 4.74 0.4 3.32 0.91 11.8 PNAN-13 1.25 10.3 0.45 3,79 0.67 6.53 0.27 3.17 0,8 6.28 PNAN-14 1.03 9.86 1.12 8.51 1.05 6.91 0.6 5.94 1.05 8.14 PNAN-15 2.28 8.1 1.93 10.4 2.14 8.86 1.56 6,84 2.31 8.61 PNAN-16 1.98 7.69 0.45 4.36 1 5.46 0.27 2.89 0.49 4.12 PNAN-17 1,72 6.72 0.75 14.8 0.74 9.26 0.49 5.58 1.98 12.8 PNAN-18 2.45 6.38 0.85 16.8 0,89 14.2 0.58 5.9 1.8 20.6 PNAN-19 1.67 5.12 0.58 8.63 0.65 5.7 0,64 8.8 1,88 2.08 PNAN-20 1.17 4.41 0.85 7.77 0.91 6.43 0.69 5.08 1.21 6.12 PNAN-21 0.31 4.18 0.48 6.95 0.19 5.09 0.15 2.1 0.29 5,93 PNAN-22 0.77 4.02 1.24 7.41 0,61 5.02 0.29 3.49 0.42 3.98 PNAN-23 0.4 1.25 0.75 6.25 0.88 5,91 0,9 5.06 0,82 6.71 PNAN-24 0.45 1.1 0,63 2.5 0.55 5.32 0,9 4.3 0.71 3.5 PNAN-25 0.36 1 0.73 2.4 0.66 5.1 0,82 4 0,7 3.4 Tabla 2: proyección de las muestras de suero de edad comparable del control en el análisis de matriz de la placa demuestran el efecto diferencial de fármacos hipolipemiantes. En comparación con los controles sin drogas (columnas 2, 3), las muestras de suero incuban con ezetimiba (columnas 4, 5), lovastatina (columnas 6, 7), simvastatina (columnas 8, 9) y niacina (columnas 10, 11) mostró variaciones de inducción lineal-en forma de LDL y HDL colesterol formación de partículas.

Discussion

En general, la distribución y propiedades funcionales de las partículas de colesterol de VLDL, LDL y HDL en la circulación de la sangre están determinados principalmente por celulares metabólicos, genéticos, epidemiológicos y factores de plasma22,23. En el presente estudio, examinando los efectos de la modificación de lípidos drogas en el tampón de revelaron que drogas altamente lipofílicas como el ezetimibe, simvastatina, lovastatina y atorvastatina inducida por una complejidad de nivel más alto en la morfología de las partículas de colesterol Comparado con el efecto de nivel más baja observado con drogas altamente hidrofílicas de rosuvastatina y fluvastatina. Estos resultados están en acuerdo con nuestro estudio anterior describiendo un mecanismo no enzimático basado en efecto de statins en la modulación de la formación de partículas de colesterol LDL y HDL en el suero y tampón de muestras21. En consecuencia, los resultados del presente estudio revelaron un mecanismo no enzimático de acción de la ezetimiba, niacina, fibrato y drogas de ácido graso omega-3 que pueden desempeñar un papel directo en la modulación de la formación de partículas de colesterol. Es posible que las interacciones entre medicamentos y agregados de colesterol conduce a la Asamblea de las partículas de colesterol de gran tamaño que son 2 a 60 μm2, exhibiendo morfologías globulares y lineal del filamento.

Además, los resultados obtenidos con las partículas de lipoproteína purificada sugieren interacciones entre agregados de colesterol y factores de plasma incluidas proteínas VLDL, LDL y HDL que pueden alterar las propiedades morfológicas del colesterol y composiciones partículas. Los resultados de tratamiento de drogas que involucra partículas de lipoproteína purificado indican un mayor efecto de nivel de drogas en la formación de partículas de VLDL en comparación con su efecto en la formación de partículas de colesterol LDL. Los medicamentos, lovastatina, simvastatina y ezetimiba fueron utilizados como pro-fármacos y sus dosis en los ensayos pueden ser superiores a las concentraciones fisiológicas.

Curiosamente, cribado de muestras de suero mostraron variaciones del efecto de la droga de alterar los perfiles de formación de partículas de colesterol VLDL, LDL y HDL, particularmente sus efectos sobre las formaciones de lineal en forma partículas de LDL y HDL. Estos fármacos inducida por reducción lineal en forma de formación de partículas de colesterol LDL y HDL en muestras de suero normales pareados por edad y dislipidemia. Los efectos de drogas observados en la reducción de formación de partículas en forma lineal fue mayor en simvastatin ezetimibe, lovastatina y niacina. La identificación de las partículas de colesterol con morfologías globulares y lineal de la cadena en las muestras de suero normal y dislipemia sugiere que partículas con morfologías similares pueden formar en condiciones de en vivo . Estudios previos han identificado la presencia de disco y cristales como agujas de colesterol en las placas ateroscleróticas de ApoE– / – humanos y LDLR– / – ratones modelos24,25,26 ,27,28.

Las partículas de HDL circulante en la sangre existen como una mezcla heterogénea y el nivel de las partículas de HDL de pequeño y gran tamaño con actividad funcional son factores importantes para ejercer su efecto cardio-protector por el transporte reverso de colesterol Ruta29,30. Estudios recientes han puesto de relieve la importancia de identificar subfracciones de partículas de colesterol de HDL para dilucidar su papel en múltiples funciones biológicas como el eflujo del colesterol, antiinflamatorio, antitrombótico y antioxidante31 . Además, varios estudios han reportado el efecto del tratamiento hipolipemiante en el aumento de un punto bajo para moderar el nivel de HDL en el plasma1,5,21. En consecuencia, los resultados de este estudio proporcionan nuevos conocimientos sobre las características morfológicas de las partículas de colesterol. En particular, la detección de un mayor nivel de partículas de colesterol HDL en forma lineales en las muestras de suero de dislipemia asignaturas sugiere que puede ser el biomarcador fiable para el diagnóstico y evaluación de efectos de la modificación de lípidos fármacos en pacientes. Sin embargo, más investigación es necesaria utilizando muestras clínicas grandes para entender mejor las partículas de colesterol con diferentes morfologías y su asociación a enfermedades cardiovasculares.

En el análisis de matriz de placa para examinar el efecto de la droga en conjunto de partículas de colesterol, utilizamos 2 μg de fluorescencia etiquetada agregados de colesterol y 5 µgof de drogas porque: (1) medicamentos competitivos se unen a ambos fluorescencia etiquetada colesterol y lípidos endógenos presentes en las muestras de suero; (2) de cada muestra, hemos adquirido 5.000 a 10.000 partículas de colesterol que se montan en grandes tamaños y formas que van desde 60 ~ 2 μ2; (3) observamos amplias variaciones de la respuesta de la droga entre las muestras de suero incubado con los medicamentos (dosis 300 ng 5 μg) y ~ 1-5% de ellos se incubaron con altas dosis no demostraron ningún cambio perceptible en el perfil de formación de partículas de colesterol; y (4) la interacción entre los agregados de colesterol y fármacos hipolipemiantes es mediada por un proceso no-enzimático. Por lo tanto, las concentraciones de los reactivos utilizados en el ensayo pueden ser superiores a su nivel fisiológico.

En conclusión, hemos demostrado con éxito las ventajas de una en vitro de método descrito en este estudio para determinar el efecto de un amplio espectro de fármacos hipolipemiantes en modulación de morfología y composición de colesterol partículas. El enfoque de visualizar y cuantificar la morfología de las partículas lipídicas mediante el empleo de una constelación de algoritmos de análisis de imagen puede ayudar a ambos el diagnóstico de aterosclerosis y para evaluar los resultados del tratamiento hipolipemiante en pacientes.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por una investigación de Plaxgen subsidio otorgado a SM (PLX-1008). Agradecemos a Palo Alto Fundación Investigación Instituto de investigación médica para recoger las muestras de suero de ateroesclerosis sujetos aprobación del IRB.

Materials

TopFluor fluorescent cholesterol Avanti Polar lipids store 100 µl aliquots at -20 °C
simvastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
lovastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
rosuvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
atorvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
fluvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
ezetimibe (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
Niacin MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
fibrate MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
omega-3 fatty acid MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
purified VLDL proteins/particles Lee Bio
purified LDL proteins/particles Lee Bio
purified HDL proteins/particles Lee Bio
Human age-matched serum Dx Biosamples
Human atherosclerosis serum Bioserve
Human normal serum Stanford Blood center
LDL measurement reagent pack Roche Diangostics
HDL measurement reagent pack Roche Diangostics
Total cholesterol measurment Roche Diangostics
96-well microtitre plates
Triglycerides measrument Roche Diangostics
Amnis Imaging Flow cytometer Amnis Inc
IDEAS image analysing software Amnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 Roche Diangostics
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Madasamy, S., Liu, D., Lundry, J., Alderete, B., Kong, R., Robinson, J. P., Wu, A. H., Amento, E. P. Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles. J. Vis. Exp. (129), e56596, doi:10.3791/56596 (2017).
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