JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

דיפרנציאלית השפעות תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים

Published: November 10, 2017
doi:
10.3791/56596
, , , , , , ,
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories,Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry,University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

Summary

מטרת מחקר זה היתה להעריך במבחנה להורדת שומנים בדם סמים אפקטים ב להתכוונן המורפולוגיה של חלקיקים כולסטרול. השוואה של התרופות להורדת שומנים בדם חשף בווריאציות השפעתם ב להתכוונן התכונות מורפולוגי של חלקיקים כולסטרול.

Abstract

טיפול dyslipidemia בחולים עם תרופות להורדת שומנים בדם מוביל לירידה משמעותית ברמת ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL), נמוכה לרמה בינונית של עליית רמת הכולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) בפלסמה. עם זאת, תפקיד אפשרי של תרופות אלו של שינוי מורפולוגיה והפצה של כולסטרול חלקיקים ממעטים להבין. כאן, אנו מתארים את הערכת במבחנה ההשפעות התרופה להורדת שומנים בדם ב להתכוונן תכוניות מורפולוגיות של כולסטרול חלקיקים באמצעות שיטת מערך פלאק בשילוב עם הדמיה cytometry זרימה. ניתוח תמונה של החלקיקים כולסטרול ציינו כי lovastatin, סימבסטטין, ezetimibe ו atorvastatin לגרום להיווצרות הכדוריים והן ליניארי סטרנד בצורת חלקיקים, ואילו ניאצין, fibrates, fluvastatin ו- rosuvastatin זירוז היווצרות הכדוריים בצורת חלקיקים בלבד. הבא, מטוהרים מאוד ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (VLDL) של חלקיקי LDL מודגרות עם תרופות אלה הראו שינויים במרקם מורפולוגיה ותמונה של כולסטרול subpopulations חלקיקים. יתר על כן, הקרנה הדוגמאות סרום 50 חשף את הנוכחות של רמה גבוהה יותר של חלקיקים כולסטרול HDL בצורת ליניארי במקצועות עם dyslipidemia (ממוצע של 18.3%) לעומת הדגימות תואם גיל נורמלי (ממוצע של 11.1%). גם הבחנו ניכר בווריאציות להורדת שומנים בדם השפעות סמים על הפחתת ליניארית בצורת ה-LDL וה -HDL כולסטרול חלקיקי צורה הדוגמאות סרום. ממצאים אלה מצביעים על תרופות להורדת שומנים בדם, בנוסף שלהם אפקטים hypolipidemic תאית, ייתכן ישירות לווסת מורפולוגיה של חלקיקים הכולסטרול על ידי מנגנון שאינו אנזימטי של פעולה. התוצאות של תוצאות אלו יש פוטנציאל כדי ליידע את אבחון של טרשת עורקים ולחזות טיפול אופטימלי להורדת שומנים בדם.

Introduction

מחקרים קליניים רבים הראו השפעות מועילות של התרופות להורדת שומנים בדם בהפחתת פלזמה רמות של כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) נמוך לרמה בינונית של עליית רמת הכולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL), אשר מונע ראשי ומשני מקרים של טרשת עורקים תופעות לוואי הקשורות לב וכלי דם1,2,3,4,5. סטטינים, קבוצת מעכבי האנזים HMG-CoA reductase, לחסום סינתזה כולסטרול אנדוגני בכבד כי התור להוביל להורדת מחזורי רמות של כולסטרול LDL ב6,הדם7. באופן דומה, השומנים הפחתת ההשפעה של ניאצין מתווך על ידי עיכוב שלה כחברים הישירים של hepatocyte diacylglycerol acyltransferase-2, אנזים הכבד מפתח מעורב הטריגליצרידים סינתזה8. יחסית, ezetimibe מפחיתה את רמת הפלסמה של LDL על-ידי הגבלת ספיגת כולסטרול אקסוגני על-ידי איגוד לחלבון נימן פיק C1-Like 1 (NPC1L1) הממוקם בתאי האפיתל של המעי הדק9. Fenofibrate, תרופה נוספת להורדת שומנים בדם, מפחית באופן משמעותי פלזמה ריכוזים של טריגליצרידים ומקטינות גם בינוני LDL כולסטרול דרך פראוקסיזום קולטנים proliferator מופעל מסלול10. חוץ מזה, חומצת שומן אומגה 3 הוא דיווח יש השפעה אנטי-טרשת עורקים עקב יכולתו להפחית את רמות פלזמה של LDL11.

התרופות להורדת שומנים בדם, בנוסף השפעתם העיקרי על הורדת רמות הכולסטרול LDL, יש מספר השפעות מועילות pleiotropic כולל שיפור רמת ה-HDL, שיפור פונקציות אנדותל, בהפחתת דלקת מעכבות טסיות הצטברויות של12,13,14. עם זאת, המנגנון הבסיסי של תרופות אלו הגדלת חלקיקי ה-HDL כולסטרול, שינוי תכונות מבניות שלהם הם לא מובן במלואו. מאז תרופות אלה ניתנות באופן נרחב לטיפול במחלות לב וכלי דם הקשורות טרשת עורקים (CVDs), זה חיוני כדי להמשיך לחקור את תפקידיהם אפשרי בקביעת תכונות מורפולוגיות והפצה של החלקיקים השומנים. Lipidome לפלסמה אנושית מורכבת ליפידים ברורים כ 600 ו-22 סוגים שונים מולקולרית של cholesterols כי קיימים מגוון גדלים, צורות, צפיפות, של יצירות15,16,17 . שיטות אנליטיות כגון אולטרה-צנטריפוגה, NMR הדרגתיים אלקטרופורזה בג’ל משמשות לאפיון חלקיקי LDL ו- HDL, שלהם18,subfractions19. עם זאת, יישום של שיטות אלה מוגבל ללימודים לקבוע את ההשפעה של תרופות להתכוונן מורפולוגיה והרכבה של החלקיקים השומנים. המערך פלאק מבוסס זרימה cytometer הוא assay הביוכימי פונקציונלי שפותחה לצורך זיהוי ויזואליזציה של סרום נגזר השומנים, עמילואיד פלאק חלקיקים20. היתרונות של במבחנה הדמיה שיטה המתוארים במחקר זה לאפשר זיהוי של השפעות סמים להתכוונן השומנים של שינוי מורפולוגיה והפצה של כולסטרול חלקיקים בתוך מאגר דגימות סרום.

Protocol

1. הכנה של פלורסנט שכותרתו כולסטרול ותרופות להורדת שומנים בדם הערה: אגרגטים התווית על-ידי פלורסנט כולסטרול סטטינים הוכנו כמתואר במאמר הקודם שלנו 21. ראה טבלה של חומרים לפרטים של ריאגנטים, הדמיה זרימה cytometer, אנלייזרים כימיה ותוכנת ניתוח נתונים השתמשו במחקר זה. Solubilize כולסטרול lyophilized התווית על-ידי פלורסנט (1 מ ג, Ex / Em = 495 ננומטר/507 ננומטר) אבקת 1 מ”ל של 100% אלכוהול. Centrifuge המדגם למשך 3 דקות ב g 2,040 x ולהשתמש את supernatants המכיל כולסטרול מסיס התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית אגרגטים וזמינותו מערך פלאק. להכנת סמים, solubilize בנפרד את אבקות (2 מ ג) של סימבסטטין, lovastatin, atorvastatin, ezetimibe חומצת שומן אומגה 3 ב 1 מ”ל של 100% אלכוהול. לאחר צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 2,040 x g, השתמש את supernatants המכילים תרופות וזמינותו. באופן דומה, solubilize בנפרד את אבקות (2 מ ג) fluvastatin, rosuvastatin, ניאצין, ו fibrate ב 1 מ”ל של מים יונים כדי ליצור פתרון מניות של 2 מ”ג/מ”ל. לאחר צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 2,040 x g, השתמש את supernatants המכילים תרופות וזמינותו מערך פלאק. 2. פלאק Assay מערך על היווצרות חלקיקים של הכולסטרול ב חוץ גופית Examining שימוש כימיה מנתח-1 (ראה טבלה של חומרים) להקים מערך פלאק וזמינותו של היווצרות חלקיקים הכולסטרול. ביצוע וזמינותו חלק תחתון עגול, חלבון נמוכה איגוד 96-ובכן צלחת באמצעות של ריאגנטים מוכן בסעיף 1. לשמר את עוצמת הקול של התגובה האחרונה כל היטב-200 µL ולבצע מבחני כל דולר. תחילה, טען 194.5 µL של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) כדי מכל קידוח. כל טוב, להוסיף 2.5 µL (5 µg) של כל פתרון התרופות להורדת שומנים בדם, לנער את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו בצלחת מנתח-1 התגובה כימיה בצורה אחידה לערבב את התרופה לתוך פתרון. אין תרופה נוספת הדגימות שליטה שלילי. לבסוף להוסיף פתרון צבירה התווית על-ידי פלורסנט כולסטרול µL (2 µg) 2 מכל קידוח, לנער את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו בצלחת מנתח-1 התגובה כימיה. דגירה על הלוחית שייקר מעבדה עבור 2 h ב 37 ° C ו 200 סל ד. לאחר דגירה, לרכוש את התמונות של חלקיקים על ידי הדמיה cytometry זרימה. 3. לכידת תמונות של כולסטרול חלקיקים באמצעות הדמיה Flow Cytometry פתח התבנית רכישת נתונים כדי לטעון את ההגדרות הכלי הנכון. לחץ על " קובץ ", ואז בחר " פתוח תבנית … " ובחר את קובץ תבנית. לחץ על " סומק, Lock, טען " להכין את הכלי עבור טעינה הדגימה. כאשר " לטעון מדגם " פותח תיבת דיאלוג, לחץ על " אישור " כדי לטעון µL 50 של הדגימות מכל אחת מוכנה היטב בסעיף 2 לתוך cytometer הדמיה זרימת. לחץ " לרוץ | הגדרת " כדי להציג את החלקיקים באזור הדמיה בזמן אמת- לחץ על כאשר החלקיקים באזור הדמיה בפוקוס טוב, " לרוץ | לרכוש " לרכוש תמונות של כל אובייקט בו זמנית באופן תפוקה גבוהה עבור שדה אפל (לצד פיזור/האס), שדה בהיר (BF), קרינה פלואורסצנטית ירוק צהוב קרינה פלואורסצנטית. חזור על השלבים 3.2-3.5 לרכוש חלקיקי 5,000-10,000 כל דגימה. לנתח כל קבצי raw התמונה באמצעות התוכנה ניתוח התמונה לקביעת עוצמת קרינה פלואורסצנטית אובייקט ווריאציות מורפולוגי. לחץ " כלי " לחצן בחלק העליון של התוכנה ניתוח תמונה ולאחר מכן בחר " אצווה, קבצי נתונים " מהתפריט הנפתח, אשר יפתח " אצוות " חלון. ב " אצוות " חלון, לחץ " אצווה להוסיף " כפתור, אשר יפתח " להגדיר אצווה " חלון. ב " להגדיר אצווה " חלון, לחץ על " הוסף קבצים " לחצן, בחר את הקבצים תמונת raw, לחץ " תבנית " לחצן, בחר את קובץ התבנית של ניתוח הנתונים המתאימים ולאחר מכן בחר " אישור ", " לשלוח אצוות " כדי להתחיל עיבוד וניתוח של הקבצים raw התמונה. 4. פלאק להורדת מערך Assay המבוסס על הערכה של השומנים סמים השפעה על חלקיקים כולסטרול מטוהר כפי שמתואר בשלב 2.1, לבצע את הבדיקה היווצרות חלקיקים הכולסטרול באמצעות מטוהרים VLDL, LDL ו- HDL lipoproteins/חלקיקים. ביצוע וזמינותו מערך פלאק בצלחת 96-ובכן. תחילה, לטעון את כל בארות עם PBS; השתמש נפח סופי 200 µL במשך כל. לשליטה שלילי, להוסיף 4 µg VLDL, LDL, או חלבונים/חלקיקי ה-HDL בכל אחד בלי סמים ולנער את הצלחת. בשביל 30 ס לבחינת ההשפעה התרופות להורדת שומנים בדם, להוסיף 4 µg VLDL, LDL, או חלבונים/חלקיקי ה-HDL בנפרד לכל אחד טוב ולנער את הצלחת. בשביל 30 ס ולס הוסיף VLDL 4 µg, LDL או HDL, להוסיף 2.5 µL (5 µg) ezetimibe, lovastatin, סימבסטטין או ניאצין פתרון ולנער את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו ב כימיה מנתח-1- לבסוף להוסיף פתרון צבירה עבור התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית כולסטרול µL (2 µg) 2 ‘ כל בארות, לנער את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו בצלחת מנתח-1 התגובה כימיה. דגירה את הצלחת. בשביל 2 h ב שייקר מעבדה ב 37 ° C ו 200 סל ד. לרכוש את הדגימות באמצעות מיכשור הדמיה בעקבות צעדים 3.1-3.5. לנתח קבצי raw תמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כפי שמתואר בשלב 3.7. בתבנית ניתוח, להשתמש בערכה המגביל הבאים עבור זיהוי של כולסטרול חלקיקים subpopulations. על מגרש של הערוץ הירוק רווי מספר הפיקסלים (ציר x) וערוץ שדה אפל ספירה פיקסל רוויים (ציר y), דחה אובייקטים עם אחד או יותר פיקסלים רוויה בכל אחד מהערוצים. מגרש החלקיקים/חפצים ללא רוויים פיקסלים בעזרת עוצמת הערוץ הירוק (ציר x) ועוצמת האס (ציר y): אובייקטים משתייכים לאחת שלושה אזורים (VLDL, LDL, HDL) מבוסס על הערוץ הירוק ועל עוצמות האס. הערה: השערים הללו נוצרו על בסיס הנתונים המופקים בקרת ניסויים מתבצעות בעזרת מטוהרים VLDL, LDL ו- HDL חלקיקים/חלבונים ללא התרופה. כדי לקבוע את האפקט התרופות להורדת שומנים בדם עבור כל דגימה, לחשב ריכוז חלקיקי ליפופרוטאין הכולל, כמו גם את האחוזים של כל subpopulation (VLDL, LDL, HDL) כשלב שמתואר 6.5. חישוב החלקיק ריכוזי (חלקיקים/mL) באמצעות המשוואה הבאה: הערה: VLDL ה LDL, HDL gating אזורים ב- dot-העלילה פלורסצנטיות לזהות ~ 80% subpopulations בהתאמה שלהם, ואת הנותרים ~ 20% של חלקיקי חפיפה עם אזורים אחרים חסימה. 5. מדידת ריכוזים השומנים ב הדוגמאות סרום לקביעת ריכוזים של LDL, HDL, הכולסטרול, הטריגליצרידים מאת מנתח כימיה-2, להשתמש הדוגמאות סרום המתקבל תואם גיל נורמלי, dyslipidemia נושאים. להגדיר ריכוז חריג של LDL, HDL, כולסטרול, טריגליצרידים בהתבסס על הריכוז שלהם לזהות מעבר הערכים העליונים והתחתונים הפניה הדוגמאות סרום. בצע recommen ערך את הפניה רגילהded ע י היצרן ריאגנט: כולסטרול (4-200 מ”ג/ד”ל), HDL (3.0-65 מ”ג/ד”ל), LDL (4-100 מ”ג/ד”ל) וטריגליצרידים (9-200 מ”ג/ד”ל). לזהות הדוגמאות סרום בעלי ערך חריג כפי מתחת לערך נמוך יותר התייחסות או מעל ההפניה גבוה יותר ערך עבור כולסטרול וטריגליצרידים, להשתמש בהם להקרנה הנוכחות ואת היעדר התרופות להורדת שומנים בדם. 6. ניתוח השפעה של סמים על היווצרות חלקיקים הכולסטרול בסרום דגימות שימוש הכימיה מנתח-1 להקים מערך פלאק וזמינותו של היווצרות חלקיקים הכולסטרול בסרום הדגימות. ביצוע וזמינותו חלק תחתון עגול, צלחת 96-ובכן מחייב חלבון נמוכה. השתמש נפח התגובה האחרונה של µL 200/היטב ולבצע מבחני כל דולר. להכין את הצלחת על-ידי טעינת ריאגנטים באופן stepwise. להכין הבארות שליטה. µL 193 עומס של PBS כדי מכל קידוח. להוסיף סרום החולה 2.5% (v/v) (דוגמה סרום אחד בלבד לכל טוב) ומנערים את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו בצלחת התגובה מנתח כימיה. µL להוסיף 2 (2 µg) של כולסטרול התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית צבירה פתרון לבאר כל ולנער את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו על צלחת מנתח-1 התגובה כימיה. להכין את הבארות עם סמים. µL 191 עומס של PBS כדי מכל קידוח. להוסיף סרום החולה 2.5% (v/v) (דוגמה סרום אחד בלבד לכל טוב) ומנערים את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו על צלחת מנתח-1 התגובה כימיה. µL 2 הוסף ezetimibe lovastatin, סימבסטטין או ניאצין לפתרון (4 µg) כל בארות מלבד הבארות שליטה שלילי. להוסיף תרופה אחת בלבד לכל טוב. וללחוץ את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו על צלחת מנתח-1 התגובה כימיה. להוסיף 2 µL של כולסטרול התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית צבירה פתרון (2 µg) לבאר כל ולנער את הצלחת. בשביל 30 s על-ידי הצבתו בצלחת מנתח-1 התגובה כימיה. לטעון סמים רק לאחר כל בארות (לשלוט ו שטופלו בסמים) היה טעון עם הדוגמאות סרום בהתאמה שלהם, ולהוסיף כולסטרול התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית בסופו של שלב זה. דגירה את הצלחת. בשביל 2 h ב שייקר מעבדה ב 37 ° C ו 200 סל ד. לרכוש את הדוגמאות על ידי הדמיה cytometer זרימה בעקבות הגדרות שתואר בשלבים 3.1-3.6. להשתמש בתמונה ניתוח תוכנה עבור כל קבצי תמונה באמצעות אותה תבנית כמתואר בצעדים 3.7 עיבוד אצווה. לבצע ניתוח הנתונים על-ידי ציור גייטס על העלילה, כפי שתואר בשלבים 4.5 ו- 4.6. כדי לקבוע להורדת שומנים בדם סמים האפקט/response (נמוך, בינוני וגבוה) עבור כל דגימה, לחשב את ריכוז החלקיקים הכולל ליפופרוטאין, כמו גם את אחוז החלקיקים הכולל הכוללת של VLDL, LDL ו- HDL subpopulations. להתוות את VLDL, LDL ו- HDL אוכלוסיית היסטוגרמה של האובייקט ' שדה בהיר התדמית, רוחב המופחת אורך (אורך – רוחב) ושער למחוזות הכדוריים או ליניארית: אובייקטים עם (אורך – רוחב) ≤ 2 מיקרומטר ליפול אזור הכדוריים לחישוב האחוז של הכדוריים, ליניארית בצורת חלקיקים. השווה את האחוז החלקיקים הכדוריים וארוך בצורת ה-LDL וה -HDL כולסטרול מזוהה עם כל מדגם סרום מודגרות עם ובלי כל תרופה. בין ערכים triplicate השיג עבור כל דגימה סרום, לקבל אחוז הכדוריים ואת ליניארית בצורת חלקיקי LDL ו- HDL שנופלים בטווח ± 2 SD עבור נחישות של אפקט סמים.

Representative Results

פלאק מערך Assay המבוסס על ניתוח להורדת שומנים בדם השפעות סמים על היווצרות חלקיקים הכולסטרול: להערכת ההשפעה של סטטינים ב להתכוונן מורפולוגיה של חלקיקים כולסטרול, כולסטרול התווית על-ידי פלורסנט אגרגטים היו מתפשט באופן אינדיבידואלי עם lovastatin, סימבסטטין, atorvastatin, rosuvastatin fluvastatin במאגר. כל דוגמאות אלה נרכשו באמצעות מיכשור הדמיה כדי ללכוד תמונות של החלקיקים כולסטרול לניתוח מורפולוגיה כפי שמוצג באיור 1 ו- 2 איור. מעניין, לנתח את השפעת התרופה על היווצרות חלקיקים הכולסטרול במאגר המצוין lovastatin, סימבסטטין, atorvastatin זירוז היווצרות של אוכלוסיה הטרוגנית של חלקיקים כולסטרול הצגת מגוון גדלים וצורות, איור 3 א -c. לעומת זאת, החלקיקים כולסטרול נוצר בנוכחות rosuvastatin, fluvastatin, ואת הפקד שלילי (ללא תרופות) היו הומוגניות צורה, מורפולוגיה כפי שמוצג באיור 3d-f. בנוסף, זה היה ציין כי lovastatin, סימבסטטין, atorvastatin המושרה היווצרות הכולסטרול חלקיקים בתערוכה שתי מורפולוגיות סטרנד הכדוריים וארוך, ואילו rosuvastatin ו fluvastatin המושרה היווצרות הכולסטרול חלקיקים עם רק הכדוריים מורפולוגיה. ההשפעה של סטטינים על גרימת היווצרות גדילי לינארי נמצאה לפי סדר 16% עבור lovastatin, 2% עבור סימבסטטין ו- 0.2% עבור atorvastatin. להעריך עוד יותר את ההשפעה של התרופות להורדת שומנים בדם על היווצרות חלקיקים, אגרגטים כולסטרול התווית על-ידי פלורסנט היו בנפרד מודגרות עם ezetimibe, fibrate, ניאצין, חומצת שומן אומגה 3. כפי שנצפה עם הסטטינים, תרופות אלו המושרה היווצרות הכולסטרול חלקיקים עם הטרוגניות גדלים וצורות, כפי שמוצג באיור 4a-d. ביניהם, ezetimibe המושרה היווצרות של חלקיקים כולסטרול מפגין בשני מורפולוגיות סטרנד הכדוריים וארוך, ואילו fibrate, ניאצין, חומצת שומן אומגה 3 המושרה היווצרות של כולסטרול היחידה הכדוריים בצורת חלקיקים. בהתאם לכך, השפעת תרופות על סטרנד ליניארית בצורת חלקיקים היווצרות הכולסטרול היה מסודר לפי 3% עבור ezetimibe, 0% עבור fibrate, 0% עבור ניאצין, ו-0% חומצת שומן אומגה 3. ניתוח מורפולוגי הנתונים גילה כל חלקיק הכולסטרול סטרנד הכדוריים או ליניארית בצורת מורכב מחלקיקים קטנים רבים מקושרים זה לזה. הגודל של חלקיקים פלורסנט חיובי כולסטרול הכדוריים שזוהו הם בטווח של ~ 2-30 מיקרומטר2, ואילו גודל החלקיקים בצורת ליניארי נמצאים בטווח של 60 ~ 2 מיקרומטר2. ניתוח ההשפעה של התרופות להורדת שומנים בדם על VLDL מטוהרים של חלקיקי LDL: לבחון עוד היווצרות חלקיקים כולסטרול בנוכחות lipoproteins, מצרפי כולסטרול התווית על-ידי פלורסנט היו מתפשט באופן אינדיבידואלי עם מטוהרים VLDL, LDL ו- HDL חלבונים/חלקיקים. התוצאות הראו, בהשוואה הדגירה עם חלקיקי LDL ו- HDL, זה מתפשט מצרפי כולסטרול עם חלבונים VLDL גרם להיווצרות מספר גבוה יותר של כולסטרול חלקיקים, איור 5. בנוסף, שני שברים עיקריים של כולסטרול חלקיקים נצפו באוכלוסיות VLDL רומז שלהם חלקית הסתדרותי שבריר LDL במהלך הדגירה עם התווית על-ידי פלורסנט כולסטרול מצרפי. ניתוח תמונה של חלקיקים מצביעות על הימצאות הכדוריים (~ 97%) והן ליניארית בצורת חלקיקים (~ 3%) בקרב אוכלוסיות VLDL, LDL ו- HDL. הטווחים גודל החלקיקים הכדוריים הם ~ 2-30 מיקרומטר2, בעוד טווחים גודל של חלקיקים לינארי ~ 2-60 מיקרומטר2. לבחינת השפעת סמים להורדת שומנים בדם על חלקיקים מטוהרים, החלקיקים VLDL ו- LDL היו מתפשט באופן אינדיבידואלי עם ezetimibe, lovastatin, סימבסטטין ניאצין. כתוצאה מכך, בהשוואה לבקרת ניסויים ללא התרופה, האפקט שנצפו על היווצרות חלקיקים VLDL היה גבוה ב ezetimibe, סימבסטטין, lovastatin, ניאצין. חלקיקי LDL מודגרות עם הסמים הראה חלק אחד מרכזי, ההשפעה תחת השפעת סמים על היווצרות חלקיקים היה גבוה ב ezetimibe, סימבסטטין, lovastatin, ניאצין, איור 6. וריאציות של ההשפעות התרופות להורדת שומנים בדם של שינוי התפלגות החלקיקים כולסטרול סרום הדגימות: הניסויים הקודמת בוצעו ב בופר עם lipoproteins השתמשו בקריסטלים ששייכים לכם להעריך את האפקט. לפיכך, בשלב הבא, היעילות של התרופות להורדת שומנים בדם על היווצרות הכולסטרול חלקיקים נבדק באמצעות דגימות סרום 50 שנאספו מן 25 נושאים עם dyslipidemia הנושאים נורמלי מתאימים לגיל 25. התגובה סמים בכל מדגם סרום נמדדה בהתבסס על שינויים בפרופיל היווצרות חלקיקים כולסטרול נוכחות, היעדרות של סמים. בפלאק מערך וזמינותו, הוקרן כל מדגם סרום נגד ezetimibe, lovastatin, סימבסטטין, ניאצין סמים. התוצאות חשף בהבדלים בין תרופות אלו במידת להתכוונן התפלגות החלקיקים VLDL, LDL ו- HDL הדוגמאות סרום, במיוחד את השפעתם על הפחתת LDL והגברת היווצרות חלקיקי ה-HDL כולסטרול. נציגי שלוש הדוגמאות סרום dyslipidemia בתערוכה ייחודית התגובות התרופות להורדת שומנים בדם מוצגים באיור 7. זיהוי של השפעת הסמים על להתכוונן המורפולוגיה של סרום נגזר LDL ו- HDL כולסטרול חלקיקים: ניתוח הנתונים פנוטיפ של כולסטרול סרום-derived חלקיקים גילה הנוכחות של גדילי לינארי והן VLDL בצורת הכדוריים, LDL, וביצע subpopulations HDL, וכך לאשר מורפולוגיה דומות זוהו בניסויים שניהם במאגר, עם חלקיקי ליפופרוטאין מטוהרים כמוצג באיור8. עם זאת, חלוקת subpopulations חלקיקים כולסטרול בצורת הכדוריים וארוך מגוונות נרחב בקרב dyslipidemia ונושאים נורמלי תואם גיל. ראוי לציין, מבחני שליטה מבוצע ללא הסמים הראה הבדלים בתחום ההפצה של גדיל ליניארית בצורת חלקיקי LDL כולסטרול בין dyslipidemia (ממוצע של 2.0%) תואם גיל נורמלי (ממוצע של 1.3%) הדוגמאות סרום. באופן דומה, רמה מוגברת של גדיל ליניארית בצורת חלקיקי ה-HDL כולסטרול נצפתה ב dyslipidemia דגימות (ממוצע של 18.3%) לעומת גיל מתאימים הדוגמאות סרום (ממוצע של 11.1%). קורלציה, ביצעה מבחני בנוכחות תרופות הדוגמאות סרום dyslipidemia הראו ירידה משמעותית במערך ליניארית בצורת ה-HDL כולסטרול חלקיקים סימבסטטין (ממוצע של 8.3%), ezetimibe (ממוצע של 11.5%), lovastatin (ממוצע של 11.7%), אין הפחתה של ניאצין (ממוצע של 18.3%). בנוסף, ירידה ביצירת ליניארית בצורת חלקיקי LDL כולסטרול נצפתה ב הדוגמאות סרום dyslipidemia כאשר מודגרות עם הסמים מוצגות בטבלה 1. יתר על כן, ביצע מבחני בנוכחות תרופות ב samp נסיוב בקרה מתאימים-גילles הראו הפחתה ליניארית בצורת חלקיקי ה-HDL כולסטרול סימבסטטין (ממוצע של 5.0%), ezetimibe (כלומר 8.2%), lovastatin (כלומר 8.7%) ו ניאצין (כלומר 10.8%) כמו באיור בטבלה 2. הן dyslipidemia והן התאימו לגיל סרום נורמלי דוגמאות המציגות שיכרון צמצום ליניארית בצורת ה-LDL וה -HDL כולסטרול החלקיקים הראו עלייה יחסית הכדוריים כולסטרול בצורת חלקיקים (נתונים לא מוצג). איור 1: דיאגרמה המדגימה את התהליך במבחנה ויזואליזציה של כולסטרול חלקיקים מורפולוגיה. (a, b) התוספת של התרופה להורדת שומנים בדם בדגימות מאגר או סרום. (ג) התוספת של כולסטרול מסיס התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית אגרגטים את הדגימות. (ד) רכישת הדגימות שנוצר עבור ניתוח מורפולוגי של כולסטרול לא מסיסים חלקיקים באמצעות הדמיה cytometry זרימה. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2: זיהוי של שני מורפולוגיות שונות של כולסטרול חלקיקים באמצעות מיכשור הדמיה- () חלקיקים הם מופרדים לאוכלוסיות ליניארי או הכדוריים מבוסס על ניתוח מרקם של תמונות שדה בהיר. באופן ספציפי, העלילה-הנקודה של הומוגניות מתכוון H (ציר x) ואני מתכוון H אנטרופיה (ציר y) מכיל שני אזורים מגודרת לגילוי הכדוריים (אדום), צירוף ליניארי בצורת חלקיקים כולסטרול (כחול). תמונות (b) הצגת מורפולוגיה של חלקיקים בצורת הכדוריים שזוהו באוכלוסיה 1. (ג) תמונות של גדיל ליניארית בצורת חלקיקים המזוהים באוכלוסיה 2. (ד) היסטוגרמה מציג את ההתפלגות של כל החלקיקים פלורסנט כולסטרול חיובי כדי לקבוע ריכוז שלהם ואת subpopulations. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3: תמונה גלריות להצגת האפקט של סטטינים להתכוונן היווצרות חלקיקים הכולסטרול. שדה בהיר מתייחס לאזור הדומה FSC ב cytometer זרימת קונבנציונלי. הערוץ הירוק מתייחס פליטת קרינה פלואורסצנטית זוהה את nm 505-560, ואת ערוץ צהוב מתייחס פליטת קרינה פלואורסצנטית זוהה של 560-595 nm. (-י) תמונות בגלריות הצגת מורפולוגיה של כולסטרול חלקיקי שנוצר בנוכחות lovastatin, סימבסטטין, atorvastatin, rosuvastatin ו- fluvastatin, בהתאמה. (f) היווצרות חלקיקים הכולסטרול בהיעדרו של סטטינים (שליטה שלילי). גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4: הדגמת השפעת תרופות להורדת שומנים בדם להתכוונן היווצרות חלקיקים הכולסטרול דיפרנציאלית. (a-d) תמונות בגלריות הצגת מורפולוגיה של חלקיקים כולסטרול נוצר בנוכחות ezetimibe, ניאצין, fibrate, חומצת שומן אומגה 3, בהתאמה. הערוץ הירוק מתייחס פליטת קרינה פלואורסצנטית זוהה את nm 505-560, ואת ערוץ צהוב מתייחס פליטת קרינה פלואורסצנטית זוהה של 560-595 nm. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5: ניתוח של VLDL, LDL ו- HDL כולסטרול חלקיקים היווצרות בהיעדר סמים. נקודה-מגרשים: ציר ה-x מציגה קשת של חלקיקים כולסטרול זוהה בערוץ ירוק קרינה פלואורסצנטית (505-560 ננומטר), ציר ה-y מציגה צד פיזור. Gating מציג אזורים של חלקיקים VLDL, LDL ו- HDL זוהה פלורסצנטיות דוט-החלקות. () היווצרות חלקיקים הכולסטרול בנוכחות VLDL מטוהרים. תמונות (b) נציג של VLDL חלקיקים. (ג) היווצרות חלקיקים הכולסטרול בנוכחות LDL מטוהרים. (ד) נציג תמונות של חלקיקי LDL. (e) היווצרות חלקיקים הכולסטרול בנוכחות HDL מטוהרים. תמונות (f) נציג של חלקיקי ה-HDL. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6: הממחיש את השפעת השומנים הנמכת סמים על טיהור VLDL ו- LDL כולסטרול חלקיקים. () VLDL חלקיקי ללא התרופה. (b) VLDL חלקיקים מודגרות עם ezetimibe. (ג) VLDL חלקיקים מודגרות עם lovastatin. (ד) VLDL חלקיקים מודגרות עם סימבסטטין. (e) VLDL חלקיקים מודגרות עם ניאצין. (f) LDL חלקיקים מודגרות ללא התרופה. (g) LDL חלקיקים מודגרות עם ezetimibe. חלקיקים (h) LDL מודגרות עם lovastatin. (אני) LDL חלקיקים מודגרות עם סימבסטטין. (j) LDL חלקיקים מודגרות עם ניאצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 7: נקודה זריחה-מציג את תופעת דיפרנציאלית של השומנים בהורדת תרופות להתכוונן VLDL, LDL ו- HDL כולסטרול חלקיקי צורה הדוגמאות סרום חלקות. בשורה העליונה, הקרנת סרום 1 מראה סמים ברמה נמוכה התגובה בהגדלת 0 היווצרות חלקיקי ה-HDL 15%; בשורה האמצעית, הקרנת סרום 2 בסה כ מציג סמים ברמה מתונה התגובה עולה 16 אל חלקיקי ה-HDL 50%; שורה תחתונה, הקרנת סרום 3 בסה כ מציג גבוה יותר סמים רמת התגובה בהגדלת 51 עד 100% חלקיקי ה-HDL. (a, f, k) הדוגמאות סרום ללא סמים. (b, g. l) הדוגמאות סרום מודגרות עם ezetimibe. (c, h, m) הדוגמאות סרום מודגרות עם lovastatin. (d, אני, n) הדוגמאות סרום מודגרות עם סימבסטטין. (e, j, o) הדוגמאות סרום מודגרות עם ניאצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 8: תמונות בגלריות הצגת מורפולוגיה של חלקיקים כולסטרול לזהות בנסיוב לטעום 1. הערוץ הירוק מציג תמונות של הפליטה זריחה של החלקיקים; לצד פיזור (ערוץ ציאן) מציג תמונות של הלייזר עירור אור מתפזרים על ידי החלקיקים. () הכדוריים וארוך כולסטרול בצורת חלקיקים נוצרו ללא התרופה. (b, c, d, e) כולסטרול חלקיקי שנוצר בנוכחות ezetimibe, lovastatin, סימבסטטין, ניאצין, בהתאמה. סרגלי קנה מידה= 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. סרום מזהה ללא סמים (בקרה) עם Ezetimibe עם Lovastatin עם סימבסטטין עם ניאצין חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % PNDS-01 1.73 45.2 0.81 18.1 0.61 16.1 0.59 13.9 2.26 33.6 PNDS-02 2.86 35.9 1.26 30.9 1.27 22.7 0.73 15.2 3.03 37.7 PNDS-03 2.04 35.8 0.87 4.82 1.02 4.14 0.36 3.06 0.45 9.57 PNDS-04 2.56 32.9 1.15 21.8 1.12 18.6 0.77 17.2 3.37 36.5 PNDS-05 0.42 29.2 0.24 5.62 0.22 8.72 0.16 9.91 0.35 22.2 PNDS-06 1.8 28.1 0.4 16.8 0.62 15 0.42 9.27 2.28 38.4 PNDS-07 1.8 26.5 0.85 10.5 1.18 19.9 0.62 7.32 1.29 23.4 PNDS-08 0.98 22.8 0.86 ולגובה 7.28 1.55 10.2 0.14 5.98 0.59 13.3 PNDS-09 3.87 22.1 1.98 9.56 1.87 10.3 1.46 7.96 2.86 9.88 PNDS-10 4.46 21.9 2.57 13.6 4.04 17.1 2.28 11.9 0.71 25.7 PNDS-11 1.57 19.2 1.15 9.24 1.37 6.98 0.74 5.03 1.37 16 PNDS-12 1.06 16.7 0.66 4.38 0.7 4.74 0.99 6.36 1.14 4.73 PNDS-13 4.85 16.6 1.28 30.4 1.4 32.6 0.8 16.6 4.02 31 PNDS-14 2.08 16 0.68 15.4 0.64 16.5 1.97 10.2 1.25 20.11 PNDS-15 1.5 11.9 1.14 13.3 1.21 11.4 0.8 6.12 1.38 4.59 PNDS-16 1.82 10.4 2.04 9.59 1.24 5.62 0.91 5.38 1.31 7.61 PNDS-17 1.05 10.3 1.02 4.7 1.78 15.1 0.93 7.81 1.27 13 PNDS-18 1.11 8.76 0.54 3.68 0.61 3.51 1.01 5.03 1.02 6.69 PNDS-19 1 8.52 0.75 6.67 0.76 5.86 0.91 8.36 1.22 11.9 PNDS-20 3.54 7.92 3.78 12 3.56 5.81 3.28 8.28 3.44 12.3 PNDS-21 1.88 7.69 2.12 11.4 1.73 9.54 1.77 8.34 2.32 16.7 PNDS-22 1.64 7.17 0.35 5.75 0.56 13.2 0.14 4.33 1.23 17.8 PNDS-23 1.54 6.27 1.25 7.24 1.02 6.12 0.73 3.58 1.42 6.69 PNDS-24 0.53 6.22 0.52 4.49 0.91 5.57 מקצועית 0.54 4.01 0.65 10.5 PNDS-25 2.97 5.1 1.59 11 1.88 9 1.03 6.54 2.61 29.1 טבלה 1: הקרנת דיסליפידמיה דוגמאות סרום וזמינותו מערך פלאק להראות את השפעת התרופות להורדת שומנים בדם דיפרנציאלית. לעומת פקדים ללא סמים (עמודים 2, 3), הדוגמאות סרום מודגרות עם ezetimibe (עמודות 4, 5), lovastatin (עמודות 6, 7), סימבסטטין (עמודות 8, 9), ניאצין (עמודות 10, 11) הראה וריאציות על גרימת ליניארית בצורת ה-LDL וה -HDL כולסטרול חלקיקי צורה. סרום מזהה בלי סמים עם Ezetimibe עם Lovastatin עם סימבסטטין עם ניאצין חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % חלקיקי LDL ליניארי % חלקיקי ה-HDL ליניארי % PNAN-01 2.05 26.8 0.62 11.9 0.56 16.9 0.52 9.28 1.4 11.9 PNAN-02 1.35 26.3 1.68 21.8 2.59 23.6 0.79 6.92 2.16 29.7 PNAN-03 2.4 24.9 0.53 7.54 0.57 13.8 0.55 5.82 1.7 4.71 PNAN-04 1.99 21.5 1.54 9.45 1.56 8.25 0.31 3.74 2.88 20.8 PNAN-05 1.77 18.8 1.49 6.03 1.65 5.5 0.54 4.67 1.2 8.19 PNAN-06 1.12 15.2 0.67 4.42 2.68 13.3 0.5 2.37 1.54 16.3 PNAN-07 1.03 14.4 0.79 6.83 1.45 7.91 0.67 5.36 1.57 12 PNAN-08 0.98 14.3 0.88 4.48 2 7.1 0.19 2.66 1.02 18.1 PNAN-09 2.85 14.1 1.95 12.6 2.34 12.5 0.7 6.24 1.84 18.7 PNAN10 1.01 10.4 0.8 5.07 0.51 5.9 0.87 6.5 1.63 10.9 PNAN-11 0.92 12.4 0.21 9.94 0.29 3.31 0.29 6.52 0.58 10.4 PNAN-12 0.6 10.5 0.56 5.78 1.06 4.74 0.4 3:32 אם כן 0.91 11.8 PNAN-13 1.25 10.3 0.45 3.79 0.67 6.53 0.27 3.17 0.8 6.28 PNAN-14 1.03 9.86 1.12 8.51 1.05 6.91 0.6 5.94 1.05 8.14 PNAN-15 2.28 8.1 1.93 10.4 2.14 8.86 1.56 6.84 2.31 8.61 PNAN-16 1.98 7.69 0.45 4.36 1 5.46 0.27 2.89 0.49 4.12 PNAN-17 1.72 6.72 0.75 14.8 0.74 9.26 0.49 5.58 1.98 12.8 PNAN-18 2.45 6.38 0.85 16.8 0.89 14.2 0.58 5.9 1.8 20.6 PNAN-19 1.67 5.12 0.58 8.63 0.65 5.7 0.64 8.8 1.88 2.08 PNAN-20 1.17 4.41 0.85 7.77 0.91 6.43 0.69 5.08 1.21 6.12 PNAN-21 0.31 4.18 0.48 6.95 0.19 5.09 0.15 2.1 0.29 השקיעו 5.93 PNAN-22 0.77 4.02 1.24 7.41 0.61 5.02 0.29 3.49 0.42 3.98 PNAN-23 0.4 1.25 0.75 6.25 0.88 5.91 0.9 5.06 0.82 6.71 PNAN-24 0.45 1.1 0.63 2.5 0.55 5.32 0.9 4.3 0.71 3.5 PNAN-25 0.36 1 0.73 2.4 0.66 5.1 0.82 4 0.7 3.4 בטבלה 2: הקרנה הדוגמאות סרום בקרת תואמות גיל ב וזמינותו מערך פלאק להראות את השפעת התרופות להורדת שומנים בדם דיפרנציאלית. לעומת פקדים ללא סמים (עמודים 2, 3), הדוגמאות סרום מודגרות עם ezetimibe (עמודות 4, 5), lovastatin (עמודות 6, 7), סימבסטטין (עמודות 8, 9), ניאצין (עמודות 10, 11) הראה וריאציות על גרימת ליניארית בצורת ה-LDL וה -HDL כולסטרול חלקיקי צורה.

Discussion

באופן כללי, הפצה ומאפיינים פונקציונלי של חלקיקים כולסטרול VLDL, LDL ו- HDL בזרם הדם נקבעים בעיקר על ידי מטבולית, גנטי, אפידמיולוגיים, סלולרי, פלזמה גורמים22,23. במחקר הנוכחי, בוחן את ההשפעות של שינוי השומנים סמים במאגר חשף כי סמים lipophilic מאוד כגון ezetimibe, lovastatin, סימבסטטין atorvastatin המושרה המורכבות ברמה גבוהה יותר על המורפולוגיה של כולסטרול חלקיקים לעומת האפקט ברמה התחתונה נצפתה עם rosuvastatin הידרופילית מאוד ותרופות fluvastatin. תוצאות אלו הינן הסכם טוב עם המחקר הקודם שלנו המתאר תופעת שאינם אנזימטי מנגנון מבוסס של סטטינים ב להתכוונן LDL ו- HDL כולסטרול היווצרות חלקיקים המאגר, סרום דגימות21. בהתאם לכך, התוצאות של המחקר הנוכחי חשף מנגנון פעולה של ezetimibe, ניאצין, fibrate, חומצת שומן אומגה 3 תרופות שעשויים לשחק תפקיד ישיר להתכוונן היווצרות הכולסטרול חלקיקים שאינם אנזימטיות. זה אפשרי כי האינטראקציות בין תרופות כולסטרול אגרגטים מוביל ההרכבה של חלקיקים כולסטרול גודל גדול 2-60 מיקרומטר2, מפגין מורפולוגיות סטרנד הכדוריים וארוך.

חוץ מזה, התוצאות המתקבלות באמצעות חלקיקי ליפופרוטאין מטוהרים מציע האינטראקציות בין כולסטרול אגרגטים גורמים פלזמה כולל חלבונים VLDL, LDL ו- HDL, אשר עשוי לשנות את יצירות והמאפיינים מורפולוגי של הכולסטרול חלקיקי. תוצאות הטיפול סמים מעורבים חלקיקי ליפופרוטאין מטוהרים הצביעו על השפעה התרופה ברמה גבוהה יותר על היווצרות חלקיקים VLDL בהשוואה השפעתם שנצפו על היווצרות חלקיקי LDL הכולסטרול. הסמים lovastatin, סימבסטטין, ezetimibe שימשו pro-סמים, את המנות שלהם, מבחני עשוי להיות גבוה יותר פיזיולוגיים ריכוזי.

מעניין, הקרנת הדוגמאות סרום הראה וריאציות של סמים השפעה על שינוי הפרופילים של היווצרות חלקיקים כולסטרול VLDL, LDL ו- HDL, במיוחד את השפעתם על המערך של ליניארית בצורת חלקיקי LDL ו- HDL. תרופות אלו המושרה הוזלת ליניארית בצורת ה-LDL וה -HDL כולסטרול היווצרות חלקיקים dyslipidemia והן הדוגמאות סרום נורמלי מתאימים-גיל. ההשפעות התרופה שנצפו על הפחתת היווצרות חלקיקים בצורת ליניארי היה גבוה ב סימבסטטין, ezetimibe, lovastatin, ניאצין. הזיהוי של כולסטרול חלקיקים עם סטרנד הכדוריים וארוך מורפולוגיות הדגימות סרום רגיל ו- dyslipidemia מרמז כי חלקיקים עם מורפולוגיות דומות עלולה להיווצר בתנאים ויוו . מחקרים קודמים זיהו הנוכחות של דיסק וגבישים דמויי מחטים כולסטרול ב הפלאק טרשת עורקים של האדם, ואת ספקיות– / – LDLR– / – עכברים מודלים24,25,26 ,27,28.

חלקיקי ה-HDL במחזור הדם קיימים כמו תערובת הטרוגנית ואת רמת של חלקיקי ה-HDL קטנים וגדולים יחד עם פעילות פונקציונלית הם גורמים חשובים להפעיל השפעתם סיבולת לב ריאה-מגן באמצעות העברת הכולסטרול הפוכה מסלול29,30. המחקרים האחרונים הדגישו את החשיבות של זיהוי ה-HDL כולסטרול חלקיקים subfractions עבור שחקרתי את תפקידם במספר תפקודים ביולוגיים בזרימת כולסטרול, פעילות אנטי דלקתית, אנטי-קדחת ו אנטי חמצון31 . בנוסף, מספר מחקרים דיווחו על ההשפעה של טיפול להורדת שומנים בדם בהגדלת נמוך עד בינוני רמת HDL פלזמה5,1,, או21. בהתאם לכך, התוצאות של מחקר זה לספק תובנות חדשות על תכונות מורפולוגיות של כולסטרול חלקיקים. ראוי לציין, הגילוי של רמה גבוהה יותר של חלקיקים כולסטרול HDL בצורת ליניארית ב הדוגמאות סרום של נושאים dyslipidemia מרמז כי הם עשויים להיות סמן אמין לאבחון והן הערכת ההשפעות של שינוי השומנים סמים בחולים. עם זאת, בהמשך החקירה נדרש באמצעות דגימות קליני גדול כדי להבין טוב יותר את החלקיקים כולסטרול עם מורפולוגיות שונות והקשר שלהן CVD.

בפלאק מערך וזמינותו לבחינת השפעת הסמים על הרכבה של כולסטרול חלקיקים, השתמשנו µg 2 של זריחה עם התווית כולסטרול אגרגטים 5 µgof סמים כי: סמים (1) והשמה לאגד שני פלורסצנטיות שכותרתו כולסטרול ו ליפידים אנדוגני להציג הדוגמאות סרום; (2) של כל מדגם, אנו רכשה 5,000 עד 10,000 כולסטרול חלקיקים מתלכדות גדול בגדלים וצורות החל ~ 2-60 ממוצע2; (3) נצפו שינויים נרחבים של סמים התגובה בין הדוגמאות סרום מודגרות עם הסמים (במינון 300 ng כדי 5 µg), ~ 1-5% מהם מודגרות במינונים גבוהים הראה לזיהוי שינויים בפרופיל של היווצרות הכולסטרול חלקיקים; ו- (4) האינטראקציה בין התרופות להורדת שומנים בדם אגרגטים כולסטרול מתווך על ידי תהליך שאינו אנזימטיות. לפיכך, ריכוזי ריאגנטים בשימוש וזמינותו עשוי להיות גבוה יותר ברמה הפיזיולוגית שלהם.

לסיכום, בהצלחה הראו יתרונות של במבחנה הדמיה שיטה המתוארים במחקר זה לקביעת השפעת קשת רחבה של התרופות להורדת שומנים בדם על להתכוונן מורפולוגיה והרכב של כולסטרול חלקיקי. הגישה של להמחיש וכימות המורפולוגיה של חלקיקים השומנים על ידי העסקת מערך של התמונה ניתוח אלגוריתמים עשוי לסייע הן את האבחנה של טרשת עורקים, וכן להעריך את תוצאות הטיפול להורדת שומנים בדם בחולים.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומן על ידי מחקר Plaxgen גרנט מוענק SM (זה במסווה-1008). אנו מודים מכון המחקר של קרן המחקר פאלו אלטו הרפואי על איסוף הדוגמאות סרום מן הנבדקים טרשת עורקים תחת אישור IRB.

Materials

TopFluor fluorescent cholesterol Avanti Polar lipids store 100 µl aliquots at -20 °C
simvastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
lovastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
rosuvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
atorvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
fluvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
ezetimibe (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
Niacin MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
fibrate MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
omega-3 fatty acid MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
purified VLDL proteins/particles Lee Bio
purified LDL proteins/particles Lee Bio
purified HDL proteins/particles Lee Bio
Human age-matched serum Dx Biosamples
Human atherosclerosis serum Bioserve
Human normal serum Stanford Blood center
LDL measurement reagent pack Roche Diangostics
HDL measurement reagent pack Roche Diangostics
Total cholesterol measurment Roche Diangostics
96-well microtitre plates
Triglycerides measrument Roche Diangostics
Amnis Imaging Flow cytometer Amnis Inc
IDEAS image analysing software Amnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 Roche Diangostics
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Pahan, K. Lipid-lowering drugs. Cell Mol Life Sci. 63, 1165-1178 (2006).
  2. Laforest, L., et al. Prevalence of low high-density lipoprotein cholesterol and hypertriglyceridaemia in patients treated with hypolipidaemic drugs. Arch Cardiovasc Dis. 102, 43-50 (2009).
  3. Roberts, W. C. Preventing and arresting coronary atherosclerosis. Am Heart J. 130, 580-600 (1995).
  4. Goldstein, J. L., Brown, M. S. A century of cholesterol and coronaries: from plaques to genes to statins. Cell. 16, 161-172 (2015).
  5. Drexel, H. Statins, fibrates, nicotinic acid, cholesterol absorption inhibitors, anion-exchange resins, omega-3 fatty acids: which drugs for which patients?. Fundam Clin Pharmacol. 23, 687-692 (2009).
  6. Camelia, S., Anca, S. Statins: Mechanism of action and effects. J.Cell.Mol.Med. 5, 378-387 (2001).
  7. Schaefer, E. J., et al. Comparisons of effects of statins (atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, and simvastatin) on fasting and postprandial lipoproteins in patients with coronary heart disease versus control subjects. Am J Cardiol. 93, 31-39 (2004).
  8. Meyers, C. D., Kamanna, V. S., Kashyap, M. L. Niacin therapy in atherosclerosis. Curr Opin in Lipid. 15, 659-665 (2004).
  9. Phan, B. A., Dayspringm, T. D., Toth, P. P. Ezetimibe therapy: mechanism of action and clinical update. Vasc Health Risk Mana. 8, 415-427 (2012).
  10. Leitersdorf, E., Fruchart, J. C. Mechanism of action of fibrates on lipid and lipoprotein metabolism. Circulation. 98, 2088-2093 (1998).
  11. Backes, J., Anzalone, D., Hilleman, D., Catini, J. The clinical relevance of omega-3 fatty acids in the management of hypertriglyceridemia. Lipids Health Dis. 15, 118 (2016).
  12. Davidson, M. H. Clinical Significance of Statin Pleiotropic Effects Hypotheses Versus Evidence. Circulation. 111, 2280-2281 (2005).
  13. Chinetti-Gbaguidi, G., Fruchart, J. C., Staels, B. Pleiotropic effects of fibrates. Curr Atheroscler Rep. 7, 396-401 (2005).
  14. McTaggart, F., Jones, P. Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit Effects of Statins on High-Density Lipoproteins: A Potential Contribution to Cardiovascular Benefit. CardiovascDrugs Ther. 22, 321-338 (2008).
  15. Quehenberger, O., et al. The Human Plasma Lipidome. N Engl J Med. 365, 1812-1823 (2011).
  16. Lund-Katz, S., et al. Mechanisms responsible for the compositional heterogeneity of nascent high density lipoprotein. J. Biol Chem. 288, 23150-23160 (2013).
  17. Krauss, R. M. Lipoprotein subfractions and cardiovascular disease risk. Curr Opin Lipidol. 21, 305-311 (2010).
  18. Krauss, R. M., Burke, D. J. Identification of multiple subclasses of plasma low density lipoproteins in normal humans. J Lipid Res. 23, 97-104 (1982).
  19. Rosenson, R. S., et al. HDL measures, particle heterogeneity, proposed nomenclature, and relation to atherosclerotic cardiovascular Events. Clinic Chemi. 57, 392-410 (2011).
  20. Madasamy, S., et al. Plaque array method and proteomics-based identification of biomarkers from Alzheimer’s disease serum. Clin Chim Acta. 441, 79-85 (2015).
  21. Madasamy, S., et al. Nonenzymatic Mechanism of Statins in Modulating Cholesterol Particles Formation. Am J Cardiol. 118, 1187-1191 (2016).
  22. Peter, O. K. Clinical relevance of the biochemical, metabolic, and genetic factors that influence low-density lipoprotein heterogeneity. Am J Cardiol. 90, 30-47 (2002).
  23. Weissglas-Volkov, D., Pajukanta, P. Genetic causes of high and low serum HDL-cholesterol. J Lipid Res. 51, 2032-2057 (2010).
  24. Abela, G. S. Effect of statins on cholesterol crystallization and atherosclerotic plaque stabilization. Am J Cardiol. 107, 1710-1717 (2011).
  25. Nidorf, S. M., Eikelboom, J. W., Thompson, P. L. Targeting cholesterol crystal-induced inflammation for the secondary prevention of cardiovascular disease. Cardiovasc Pharmacol Ther. 19, 45-52 (2014).
  26. Thacker, S. G., Zarzour, A., Chen, , et al. High density lipoprotein reduces inflammation from cholesterol crystals by inhibiting inflammasome activation. Immunol. 149, 306-319 (2016).
  27. Kim, S. H., Lee, E. S., Lee, J. Y., et al. Multiplex coherent anti-stokes Raman Spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circ Res. 106, 1332-1341 (2010).
  28. Lim, R. S., Suhalim, J. L., Miyazaki-Anzai, S., et al. Identification of cholesterol crystals in plaques of atherosclerotic mice using hyperspectral CARS imaging. J Lipid Res. 52, 2177-2186 (2011).
  29. Rothblat, G. H., Phillips, M. C. High-density lipoprotein heterogeneity and function in reverse cholesterol transport. Curr Opin Lipidol. 21, 229-238 (2011).
  30. Kontush, A. HDL particle number and size as predictors of cardiovascular disease. Front in Pharmacol. , (2015).
  31. Karathanasis, S. K., Freeman, L. A., Gordon, S. M., Remaley, A. T. The changing face of HDL and the best way to measure it. Clin. Chem. 63, 196-210 (2017).

Tags

Cholesterol ParticlesLipid-lowering DrugsPlaque ArrayMorphological FeaturesIn Vitro ImagingBiomarkersAtherosclerosisChemistry AnalyzerImaging Flow CytometryData Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Madasamy, S., Liu, D., Lundry, J., Alderete, B., Kong, R., Robinson, J. P., Wu, A. H., Amento, E. P. Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles. J. Vis. Exp. (129), e56596, doi:10.3791/56596 (2017).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image