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Medicina

Effets différentiels des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol

Published: November 10, 2017
doi:
10.3791/56596
, , , , , , ,
1Plaxgen Inc, 2Millipore Sigma, 3Cytometry Laboratories,Purdue University, 4San Francisco General Hospital, 2M16 Clinical Chemistry,University of California, San Francisco, 5Molecular Medicine Research Institute

Summary

L’objectif de cette étude était d’évaluer in vitro les effets des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol. Comparaison des médicaments hypolipidémiants ont révélé des variations dans leurs effets en modulant les caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol.

Abstract

Traitement des dyslipidémies diabétiques hypolipidémiants conduit à une réduction significative au niveau des lipoprotéines de basse densité (LDL) et un faible à un niveau modéré de l’augmentation du cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL) dans le plasma. Toutefois, un rôle éventuel de ces médicaments dans l’altération de la morphologie et la distribution des particules de cholestérol est mal compris. Nous décrivons ici l’évaluation in vitro des effets des médicaments hypolipidémiants dans la modulation des caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol à l’aide de la méthode array et plaque en combinaison avec l’imagerie de cytométrie en flux. Analyses d’image des particules de cholestérol indiquent que lovastatine, simvastatine, l’ézétimibe et l’atorvastatine induisent la formation de particules en forme de chapelet globulaires et linéaires, alors que la niacine et fibrates, fluvastatine, rosuvastatine induisent la formation de seulement des particules en forme de forme globulaire. Ensuite, très purifiée de lipoprotéines de basse densité (VLDL) et des particules de LDL incubées avec ces médicaments ont montré des changements dans la texture de la morphologie et l’image du cholestérol sous-populations de particules. En outre, dépistage de 50 échantillons de sérum ont révélé la présence d’un niveau plus élevé de particules en forme linéaires de cholestérol HDL chez les sujets atteints de dyslipidémie (moyenne de 18,3 %) comparée aux échantillons appariés selon l’âge normal (moyenne de 11,1 %). Nous avons également observé des variations considérables dans les effets des médicaments hypolipidémiants sur la réduction des linéaires en forme de formation de particules de cholestérol LDL et de HDL dans le sérum. Ces résultats indiquent que les médicaments hypolipidémiants, outre leurs effets hypolipémiants à médiation cellulaire, peuvent moduler directement la morphologie des particules de cholestérol par un mécanisme non enzymatique de l’action. Les résultats de ces résultats ont un potentiel pour informer le diagnostic d’athérosclérose et prévoir un traitement hypolipidémiant optimal.

Introduction

De nombreuses études cliniques ont démontré les effets bénéfiques des médicaments hypolipidémiants dans la réduction des taux plasmatiques de cholestérol des lipoprotéines de basse densité (LDL) et une faible à un niveau modéré de l’augmentation du cholestérol des lipoprotéines de haute densité (HDL), qui empêche les primaires et secondaires de l’incidence des événements cardiovasculaires liées à l’athérosclérose1,2,3,4,5. Statines, un groupe d’inhibiteurs de l’enzyme HMG-CoA réductase, bloquent la synthèse du cholestérol endogène dans le foie qu’à son tour pour abaisser la circulation des niveaux de cholestérol LDL dans le sang6,7. De même, l’effet de la niacine hypolipidémiants est médiée par son inhibition directe et non compétitive des hépatocytes diacylglycerol acyltransferase-2, une enzyme du foie clée impliqués dans la synthèse de triglycérides8. Comparativement, ezetimibe réduit le taux plasmatique de LDL en limitant l’absorption du cholestérol exogène en se liant à la protéine de Niemann-Pick C1-Like 1 (NPC1L1) situé dans les cellules épithéliales de l’ intestin grêle9. Fénofibrate, un autre médicament hypolipidémiant, réduit considérablement les concentrations plasmatiques de triglycérides et aussi modérément réduit le cholestérol LDL dans les peroxysomes récepteurs activés par les proliférateurs voie10. En outre, acide gras oméga-3 est rapporté pour avoir l’effet anti-athérosclérotiques en raison de sa capacité de réduire les concentrations plasmatiques de LDL11.

Les médicaments hypolipidémiants, en plus de leur effet principal sur l’abaissement du cholestérol LDL, ont un certain nombre d’effets pléiotropiques bénéfiques, notamment améliorer le niveau de HDL, améliorer les fonctions endothéliales, réduisant l’inflammation et inhibition plaquettaire agrégations12,13,14. Toutefois, le mécanisme sous-jacent de ces médicaments en augmentant les particules de cholestérol HDL et en modifiant leurs caractéristiques structurelles ne sont pas entièrement compris. Puisque ces médicaments sont largement prescrits pour traiter les maladies cardiovasculaires liées à l’athérosclérose (CVDs), il est essentiel d’approfondir leur rôle possible dans la détermination des caractéristiques morphologiques et la distribution des particules lipidiques. Le lipidome de plasma humain se compose d’environ 600 lipides distinctes et 22 différents modèles moléculaires de cholestérol qui sont présents dans diverses tailles, formes, densités et compositions15,16,17 . Méthodes d’analyse telles qu’ultra-centrifugation, RMN et électrophorèse sur gel en gradient sont utilisées pour caractériser les particules de LDL et HDL et les sous-fractions18,19. Toutefois, l’application de ces méthodes est limitée à des études visant à déterminer l’effet des drogues dans la modulation de la morphologie et l’assemblage des particules lipidiques. Le tableau de base plaque cytomètre en flux est un dosage biochimique fonctionnel développé pour la détection et la visualisation de sérum provenant de particules plaque amyloïde et lipides20. Les avantages de in vitro méthode décrite dans la présente étude d’imagerie permettent d’identifier lipide-moduler les effets des médicaments dans l’altération de la morphologie et la distribution des particules de cholestérol dans les échantillons de sérum et de la mémoire tampon.

Protocol

1. préparation des fluorescents marqués au cholestérol et médicaments hypolipidémiants Remarque : agrégats Fluorescent-étiquetées de cholestérol et les statines ont été préparés comme indiqué dans notre précédent article 21. s’il vous plaît voir Table des matières pour plus de détails de réactifs, d’imagerie cytomètre en flux, analyseurs et logiciel d’analyse de données utilisées dans cette étude. Solubiliser fluorescent-étiquetées lyophilisée cholestérol (mg 1, Ex / Em = 495 nm/507 nm) en poudre dans 1 mL d’alcool à 100 %. Centrifuger l’échantillon pendant 3 min à 2 040 x g et utiliser les fractions surnageantes contenant des agrégats de cholestérol de fluorescence-étiquetée soluble dans l’essai de plaque tableau. Pour la préparation de médicaments, individuellement solubiliser les poudres (2 mg) de la simvastatine, la lovastatine, atorvastatine, ezetimibe et acides gras oméga-3 dans 1 ml d’alcool à 100 %. Après centrifugation pendant 3 min à 2 040 x g, utiliser les fractions surnageantes contenant des médicaments dans le dosage. De la même façon, solubiliser individuellement les poudres (2 mg) de la fluvastatine, rosuvastatine, niacine et fibrate dans 1 mL d’eau déminéralisée pour faire une solution de 2 mg/mL. Après centrifugation pendant 3 min à 2 040 x g, utiliser les fractions surnageantes contenant des médicaments dans l’essai de plaque tableau. 2. Plaque tableau dosage pour la Formation de particules de cholestérol examen In Vitro emploi chimie analyseur-1 (voir Table des matières) pour mettre en place le test de tableau de plaque pour la formation de particules de cholestérol. Effectuez le test dans un fond rond, plaque à 96 puits hypoprotidique liaison utilisant les réactifs préparés dans la Section 1. Maintenir le volume de réaction finale dans chaque puits à 200 µL et effectuer tous les essais en triple exemplaire. Tout d’abord, charge 194,5 µL de phosphate buffered saline (PBS) dans chaque puits. Pour chaque puits, ajouter 2,5 µL (5 µg) de chaque solution de médicaments hypolipidémiants et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de réaction analyseur-1 chimie mélanger uniformément le médicament en solution. Aucun médicament n’est ajouté pour les échantillons de contrôle négatif. Enfin, ajouter 2 µL (2 µg) fluorescent-étiquetées cholestérol global solution dans chaque puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de chimie réaction analyseur-1. Incuber la plaque sur un agitateur de laboratoire pendant 2 h à 37 ° C et 200 tr/min. Après l’incubation, acquérir les images de particules par imagerie cytométrie. 3. Capture d’Images de cholestérol des particules à l’aide d’imagerie Flow Cytometry ouvert le modèle d’acquisition de données pour charger les paramètres de l’instrument approprié. Cliquez sur " fichier ", puis sélectionnez " modèle Open … " et sélectionnez le modèle fichier. Cliquez " Flush, serrure, charge " de préparer l’instrument pour le chargement de l’échantillon. Lorsque la " Load Sample " dialogue boîte s’ouvre, cliquez sur " OK " pour charger 50 µL des échantillons de chaque bien préparés à l’article 2 dans le cytomètre imagerie. Cliquez sur " courir | Le programme d’installation " pour voir les particules de la zone d’imagerie en temps réel. Lorsque les particules dans la zone d’imagerie sont en bonne discussion, cliquez sur " exécuter | Acquérir " d’acquérir des images de chaque objet en même temps de manière à haut débit pour champ sombre (côté scatter/SSC), champ lumineux (BF), fluorescence verte et fluorescence jaune. Répétez les points 3.2-3.5 pour acquérir 5 000-10 000 particules de chaque échantillon. Analyser tous les fichiers image raw à l’aide de logiciels d’analyse de l’image permettant de déterminer l’intensité de fluorescence d’objet et de variations morphologiques. Cliquez le " outils " bouton en haut du logiciel d’analyse de l’image, puis sélectionnez " par lots des fichiers de données " dans le menu déroulant, qui ouvrira la " lots " fenêtre. Dans la " lots " fenêtre, cliquez sur le " ajouter lot " bouton, qui ouvrira ses portes le " définir un lot " fenêtre. Dans la " définir un lot " fenêtre, cliquez sur le " ajouter des fichiers " bouton et sélectionnez les fichiers image raw, cliquez sur le " modèle " bouton et sélectionnez le fichier de modèle de l’analyse de données approprié, puis sélectionnez " OK " et " lots de présenter " pour commencer le traitement et l’analyse des fichiers image raw. 4. Plaque tableau dosage selon évaluation de médicaments effet hypolipidémiant sur les particules de cholestérol purifié comme indiqué au point 2.1, effectuer le test de formation de particules de cholestérol utilisant des particules/lipoprotéines VLDL, LDL et HDL purifiées. Effectuer l’essai de tableau plaque dans une plaque à 96 puits. Tout d’abord, chargez tous les puits avec du PBS ; utiliser un volume final de 200 µL à chaque puits. Pour contrôle négatif, ajouter 4 µg VLDL, LDL, ou les protéines/particules HDL individuellement dans chaque bien sans drogue et secouer la plaque pendant 30 s. Pour étudier l’effet de médicaments hypolipidémiants, ajouter 4 µg VLDL, LDL, ou les protéines/particules HDL individuellement à chaque bien et secouer la plaque pendant 30 s. Wells additionné de 4 µg VLDL, LDL ou HDL, ajouter 2,5 µL (5 µg) de solution de l’ézétimibe, lovastatine, simvastatine ou niacine et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant dans l’analyseur de chimie-1. Enfin, ajouter 2 µL (2 µg) marqués par fluorescence cholestérol global solution à tous les puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de chimie réaction analyseur-1. Incuber la plaque pendant 2 h dans un shaker lab fixé à 37 ° C et 200 tr/min. Acquérir les échantillons à l’aide d’imagerie cytométrie en suivant les étapes 3.1-3.5. Analyser les fichiers d’images raw à l’aide de logiciels d’analyse image comme indiqué au point 3.7. Dans le modèle d’analyse, utilisez le schéma suivant de blocage pour l’identification des sous-populations de particules de cholestérol. Sur un terrain de canal vert saturé de pixels (axe x) et le champ sombre canal saturé de pixels (axe y), rejeter les objets avec un ou plusieurs pixels saturés dans des canaux. Tracer les objets/particules sans pixel saturé en utilisant l’intensité du canal vert (axe x) et l’intensité SSC (axe y) : objets tombent dans l’une des trois régions (VLDL, LDL, HDL) selon leur couche verte et les intensités SSC. Remarque : Ces portes ont été créés basés sur les données générées par des expériences de contrôle effectués à l’aide de VLDL, LDL et HDL particules/protéines purifiées sans médicament. Pour déterminer l’effet de médicaments hypolipidémiants pour chaque échantillon, calculer les concentrations de particules lipoprotéiques total, ainsi que le pourcentage de chaque sous-population (VLDL, LDL, HDL) comme décrit dans étape 6.5. Des concentrations de calculer les particules (particules/mL) selon l’équation suivante : Remarque : les VLDL, LDL et HDL gating régions dans la fluorescence dot-parcelle détecter ~ 80 % de leurs populations respectives et les autres ~ 20 % des particules de chevauchement avec d’autres régions gating. 5. Mesure des Concentrations des lipides dans les échantillons de sérum pour la détermination des concentrations de LDL, HDL, cholestérol et triglycérides par analyseur de chimie-2, utiliser des échantillons de sérum prélevés appariés selon l’âge des sujets normaux et les dyslipidémies. Définir une concentration anormale de LDL, HDL, cholestérol et triglycérides selon leur concentration identifiée au-delà des valeurs de référence supérieure et inférieure dans le sérum. Suivre la référence normale valeur recommanDED par le fabricant de réactifs : cholestérol (4-200 mg/dL), HDL (3.0-65 mg/dL), LDL (4 à 100 mg/dL) et les triglycérides (9 à 200 mg/dL). Identifier les échantillons de sérum qui ont une valeur anormale que soit inférieure à la valeur de référence inférieure ou au-dessus de la mention plue de valeur pour le cholestérol et les triglycérides et utilisez-les pour le dépistage de la présence et l’absence de médicaments hypolipidémiants. 6. Analyser les effets de la drogue sur la Formation de particules de cholestérol dans le sérum utiliser la chimie analyseur-1 à mettre en place le test de tableau de plaque pour la formation de particules de cholestérol dans le sérum. Effectuez le test dans un fond rond, plaque à 96 puits liaison faible en protéines. Utiliser un réactionnel final de 200 µL/puits et effectuer tous les essais en triple exemplaire. Préparer le plateau en chargeant des réactifs de manière graduelle. Préparer les puits témoins de. Charge 193 µL de PBS dans chaque cupule. Ajouter de sérum de patient de 2,5 % (v/v) (échantillon de seul sérum / puits) et agiter la plaque pendant 30 s en le plaçant sur la plaque de réaction Chimie analyseur. Ajouter 2 µL (2 µg) de fluorescence-étiquetée cholestérol total solution dans chaque puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur une plaque de réaction analyseur-1 chimie. Préparer les puits avec des médicaments. Charge 191 µL de PBS dans chaque cupule. Ajouter de sérum de patient de 2,5 % (v/v) (échantillon de seul sérum / puits) et agiter la plaque pendant 30 s en le plaçant sur une plaque de réaction analyseur-1 chimie. Ajouter 2 µL ezetimibe, lovastatine, simvastatine ou niacine solution (4 µg) pour tous les puits sauf les puits de contrôle négatif. Ajouter qu’un seul médicament / puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur une plaque de réaction analyseur-1 chimie. Ajouter 2 µL de fluorescence-étiquetée cholestérol total solution (2 µg) dans chaque puits et secouer la plaque pour 30 s en le plaçant sur la plaque de chimie réaction analyseur-1. Charger des drogues qu’après tous les puits (témoins et traités) ont été chargés avec leurs échantillons de sérum respectifs et ajouter le cholestérol marqués par fluorescence à la fin de cette étape. Incuber la plaque pendant 2 h dans un shaker lab fixé à 37 ° C et 200 tr/min. Acquérir les échantillons par imagerie cytomètre de flux après réglages décrits aux étapes 3.1-3.6. Utiliser l’image analyser les logiciels pour tous les fichiers d’image en utilisant le même modèle comme décrit aux étapes 3,7 de traitement par lot. Effectuer l’analyse des données en dessinant des portes sur le terrain, comme indiqué aux paragraphes 4.5 et 4.6. Pour déterminer la hypolipidémiants effet/réaction aux médicaments (faible, modérée et élevée) pour chaque échantillon, calculer la concentration de particules lipoprotéiques total, ainsi que le pourcentage du totales particules comprenant des VLDL, LDL et HDL sous-populations. Tracer les populations VLDL, LDL et HDL sur un histogramme de l’objet ' s lumineux zone image, largeur soustraite de longueur (longueur – largeur) et porte en régions globulaires ou linéaires : objets (longueur – largeur) ≤ 2 µm tombent dans le région globulaire pour calculer le pourcentage de forme globulaire et linéaire en forme de particules. Comparer le pourcentage de globulaires et linéaires en forme LDL et HDL cholestérol particules identifiées pour chaque échantillon de sérum incubé avec et sans drogue. Parmi les valeurs en triple obtenus pour chaque échantillon de sérum, accepter le pourcentage de forme globulaire et linéaire en forme des particules LDL et HDL qui entrent dans la gamme ±2 SD pour la détermination de l’effet de la drogue.

Representative Results

Plaque tableau dosage selon l’analyse des effets des médicaments hypolipidémiants sur la Formation de particules de cholestérol : Pour évaluer l’effet des statines dans la modulation de la morphologie des particules de cholestérol, les agrégats fluorescent-étiquetées de cholestérol ont été incubés individuellement avec la lovastatine, simvastatine, atorvastatine, rosuvastatine et la fluvastatine dans la mémoire tampon. Tous ces échantillons ont été recueillies à l’aide d’imagerie cytométrie pour capturer des images des particules de cholestérol pour l’analyse de la morphologie comme illustré dans la Figure 1 et Figure 2. Fait intéressant, analysant l’effet des drogues sur la formation de particules de cholestérol dans le tampon a indiqué que la lovastatine, simvastatine et atorvastatine induisent la formation d’une population hétérogène de particules de cholestérol affichant diverses tailles et formes, Figure 3 a -c. À l’inverse, les particules de cholestérol forment en présence de la rosuvastatine, fluvastatine, et le témoin négatif (sans médicament) étaient homogènes dans la forme et de la morphologie, comme illustré à la Figure 3d-f. En outre, il a été observé que lovastatine, simvastatine et l’atorvastatine a induit la formation de particules de cholestérol présentant les deux morphologies brin globuleux et linéaire, alors que la rosuvastatine et la fluvastatine induisent la formation de cholestérol particules avec seulement une morphologie globulaire. L’effet des statines sur induisant la formation de brins linéaire a été trouvé dans l’ordre de 16 % pour la lovastatine, 2 % pour la simvastatine et 0,2 % pour l’atorvastatine. Pour continuer à évaluer l’effet des médicaments hypolipidémiants sur la formation de particules, agrégats fluorescent-étiquetées de cholestérol ont été individuellement incubées avec l’ézétimibe, fibrate, niacine et acide gras oméga-3. Comme observé avec les statines, ces médicaments induisent la formation de particules de cholestérol avec des tailles hétérogènes et des formes comme illustré à la Figure 4 a-d. Parmi eux, l’ezetimibe induit la formation de particules de cholestérol présentant les deux morphologies brin globuleux et linéaire tandis que fibrate, niacine et acide gras oméga-3 induisent la formation de particules seul cholestérol en forme globulaire. En conséquence, l’effet des drogues sur le brin linéaire en forme de formation de particules de cholestérol était de l’ordre de 3 % pour l’ézétimibe, 0 % pour fibrate, 0 % pour la niacine et 0 % pour les acides gras oméga-3. L’analyse morphologique révèle chaque particule de cholestérol brin globuleux ou linéaire en forme se compose de nombreuses petites particules reliés entre eux. Les tailles de particules fluorescentes cholestérol globulaire positive identifiées sont de l’ordre de ~ 2-30 µm2, tandis que les tailles des particules en forme linéaires sont de l’ordre de ~ 2-60 µm2. Analyser l’effet de médicaments hypolipidémiants sur purifiée des VLDL et des particules de LDL : Pour examiner davantage la formation de particules de cholestérol en présence de lipoprotéines, les agrégats de cholestérol fluorescent-étiquetées incubés individuellement avec les protéines/particules purifiées VLDL, LDL et HDL. Les résultats ont montré, par rapport à l’incubation avec des particules de LDL et HDL, que les agrégats de cholestérol incubées avec des protéines de VLDL entraîne la formation d’un plus grand nombre de particules de cholestérol, Figure 5. En outre, deux des principales fractions de particules de cholestérol ont été observées dans les populations de VLDL suggérant leur transformation partielle en une fraction LDL durant l’incubation avec les agrégats de cholestérol fluorescent-étiquetées. L’analyse des images des particules a révélé la présence de forme globulaire (~ 97 %) et des particules (~ 3 %) en forme linéaires entre les populations de VLDL, LDL et HDL. Les gammes de dimension des particules globulaires sont ~ 2-30 µm2, alors que les gammes de dimension des particules linéaires sont ~ 2-60 µm2. Pour l’examen de l’effet de médicaments hypolipidémiants sur particules purifiées, les particules de VLDL et les LDL incubées individuellement avec l’ézétimibe, lovastatine, simvastatine et niacine. Ainsi, par rapport aux expériences de contrôle sans la drogue, l’effet de drogues observée sur la formation de particules de VLDL était plus élevé dans l’ézétimibe, simvastatine, lovastatine et niacine. Les particules de LDL incubées avec les médicaments ont montré une seule fraction majeure et l’effet sur la formation de particules induite par le médicament était plus élevée chez l’ézétimibe, simvastatine, lovastatine et niacine, Figure 6. Variations de l’effets des médicaments hypolipidémiants dans l’altération de la Distribution des particules de cholestérol dans le sérum : Les expériences précédentes ont été effectuées dans la solution tampon avec des lipoprotéines purifiées pour évaluer l’effet de la drogue. Par conséquent, dans l’étape suivante, l’efficacité des médicaments hypolipidémiants sur la formation de particules de cholestérol a été étudiée à l’aide de 50 échantillons de sérum prélevés dans 25 sujets dyslipidémiques et 25 sujets normaux appariés selon l’âge. La réponse de drogue dans chaque échantillon de sérum a été mesurée selon les changements dans le profil de formation de particules de cholestérol en présence et en absence de médicaments. Dans l’essai de plaque tableau, chaque échantillon de sérum a été projeté contre l’ezetimibe, lovastatine, simvastatine et les médicaments de la niacine. Les résultats ont révélé des disparités parmi ces drogues dans la modulation de la distribution des particules de VLDL, LDL et HDL dans le sérum, particulièrement leur effet sur la réduction des LDL et augmente la formation de particules de cholestérol HDL. Trois représentants des échantillons de sérum de dyslipidémie présentant des réponses uniques aux médicaments hypolipidémiants sont indiquées à la Figure 7. Identification de l’effet de la drogue sur la morphologie modulante de sérum provenant de LDL et HDL cholestérol particules : L’analyse du phénotype des particules de cholestérol sérique dérivés a révélé la présence de brins linéaires et globulaire en forme VLDL, LDL, et sous-populations de HDL, ce qui confirme une morphologie similaire identifiée dans les expériences effectuées aussi bien dans la mémoire tampon et avec les particules lipoprotéiques purifiée tel qu’illustré à la Figure 8. Toutefois, la répartition des sous-populations de particules de cholestérol forme globulaire et linéaires largement varié dyslipidémie et appariés selon l’âge des sujets normaux. En particulier, les essais de contrôle effectués sans les médicaments ont montré des différences dans la distribution du brin linéaire en forme de particules de cholestérol LDL entre dyslipidémie (moyenne de 2,0 %) et appariés selon l’âge normal (moyenne de 1,3 %) échantillons de sérum. De même, une augmentation du niveau du brin linéaire en forme de particules de cholestérol HDL a été observé dans des échantillons de dyslipidémie (moyenne de 18,3 %) par rapport à la même âge (moyenne de 11,1 %) échantillons de sérum. En corrélation, les analyses effectuées en présence de médicaments dans des échantillons de sérum de dyslipidémie a montré une réduction significative en linéaire en forme formation de particules cholestérol HDL pour la simvastatine (moyenne de 8,3 %), l’ézétimibe (moyenne de 11,5 %), lovastatine (moyenne de 11,7 %), et pas de réduction pour la niacine (moyenne de 18,3 %). En outre, une diminution de la formation de linéaire en forme particules de cholestérol LDL a été observée dans des échantillons de sérum de dyslipidémie incubés avec les médicaments affichées dans le tableau 1. En outre, les analyses effectuées en présence de médicaments dans samp sérum témoins du même âgeles a montré une réduction importante dans les linéaires en forme de particules de cholestérol HDL dans la simvastatine (moyenne de 5,0 %), l’ézétimibe (moyenne de 8,2 %), lovastatine (moyenne de 8,7 %) et niacine (moyenne 10,8 %) comme le montre le tableau 2. Dyslipidémie et sérum normal appariés selon l’âge des échantillons présentant la réduction induite par le médicament dans les linéaires en forme LDL et HDL cholestérol particules ont montré une augmentation relative dans les particules de cholestérol forme globulaire (données non présentées). Figure 1 : Schéma illustrant le processus de visualisation de in vitro de la morphologie des particules de cholestérol. (a, b) L’ajout de médicaments hypolipidémiants dans des échantillons de sérum ou de la mémoire tampon. (c), l’ajout de fluorescence-étiquetée soluble cholestérol chaînettes aux échantillons. (d) acquérir les échantillons qui en résulte pour l’analyse morphologique des particules de cholestérol insoluble à l’aide d’imagerie de cytométrie en flux. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Identification de deux morphologies distinctes des particules de cholestérol à l’aide d’imagerie cytométrie. (a) les particules sont séparés en populations linéaires ou globulaires basées sur l’analyse de texture des images champ lumineux. Plus précisément, la dot-terrain signifie H homogénéité (axe x) et signifie H entropie (axe y) contient deux régions fermées pour la détection de forme globulaire (rouge), et le brin linéaire en forme de particules de cholestérol (en bleu). (b) des Images montrant la morphologie des particules en forme globulaires, dans la population 1. (c) des Images du brin linéaire en forme de particules dans la population 2. (d) histogramme affiche la distribution de toutes les particules de cholestérol positive fluorescente utilisée pour déterminer leur concentration et sous-populations. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Image galleries montrant l’effet des statines dans la modulation de la formation de particules de cholestérol. Champ lumineux désigne la zone similaire à FSC dans le cytomètre classiques. Voie verte fait référence à l’émission de fluorescence détectée dans la 505-560 nm, et canal jaune se réfère à l’émission de fluorescence détectée dans la 560-595 nm. (a à e) Galeries d’images affichant la morphologie des particules de cholestérol formés en présence de la lovastatine, simvastatine, atorvastatine, rosuvastatine et la fluvastatine, respectivement. (f) de la formation de particules de cholestérol en l’absence de statine (témoin négatif). Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : démonstration de l’effet différentiel des médicaments hypolipidémiants dans la modulation de la formation de particules de cholestérol. (a-d) Galeries d’images affichant la morphologie des particules de cholestérol forment en présence de l’ézétimibe, niacine, fibrate et acide gras oméga-3, respectivement. Voie verte fait référence à l’émission de fluorescence détectée dans la 505-560 nm, et canal jaune se réfère à l’émission de fluorescence détectée dans la 560-595 nm. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : analyse des VLDL, LDL et HDL cholestérol particules formation en l’absence de drogue. Dot-emplacements : Axe des abscisses affiche un spectre de particules de cholestérol détectée dans le canal de fluorescence verte (505-560 nm) et axe y diffusion latérale. Gating montre régions de VLDL, LDL et HDL particules détectées dans les parcelles-dot de fluorescence. (a) formation de particules de cholestérol en présence de VLDL purifiée. (b), représentant des images de particules de VLDL. (c) formation de particules de cholestérol en présence de LDL purifiée. (d), représentant des images de particules LDL. (e) formation de particules de cholestérol en présence de HDL purifiée. (f), représentant des images de particules HDL. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : démontrant l’effet des médicaments hypolipidémiants sur purifiée des particules de cholestérol LDL et VLDL. (un) VLDL particules sans la drogue. (b), VLDL particules incubées avec l’ézétimibe. (c), VLDL particules incubées avec la lovastatine. (d), VLDL particules incubées avec la simvastatine. (e), VLDL particules incubées avec la niacine. particules (f), LDL incubées sans la drogue. particules (g), LDL incubées avec l’ézétimibe. particules (h), LDL incubées avec la lovastatine. particules (j’ai) LDL incubées avec la simvastatine. particules (j), LDL incubées avec la niacine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Fluorescence dot-emplacements montrant un effet différentiel des médicaments dans la modulation des VLDL, LDL et HDL formation de particules de cholestérol dans le sérum hypolipidémiants. Rangée du haut, la projection de sérum 1 affichage de faible niveau la réaction aux médicaments en augmentant de 0 à 15 % formation de particules HDL ; rangée du milieu, la projection de sérum 2 montrant modéré niveau la réaction aux médicaments en augmentant de 16 à 50 % des particules HDL ; Rangée du bas, la projection de la réaction aux médicaments niveau supérieure sérum 3 montrant dans l’augmentation de 51 à 100 % les particules HDL. (a, f, k) Échantillons de sérum sans médicaments. (b, g, l) Échantillons de sérum incubées avec l’ézétimibe. (c, h, m) Échantillons de sérum incubé avec la lovastatine. (d, i, n) Échantillons de sérum incubé avec la simvastatine. (e, j, o) Échantillons de sérum incubé avec la niacine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 8 : galeries d’images affichant la morphologie des particules de cholestérol identifiée dans le sérum de l’échantillon 1. Canal vert montre des images de l’émission de fluorescence des particules ; diffusion latérale (canal cyan) montre des images du laser excitation lumière diffusée par les particules. (un) cholestérol forme globulaire et linéaire particules formées sans la drogue. (b, c, d, e) Les particules de cholestérol forment en présence de l’ézétimibe, lovastatine, simvastatine et niacine, respectivement. Barreaux de l’échelle= 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. ID de sérum Sans drogue (contrôle) Avec l’ézétimibe Avec la lovastatine Avec la simvastatine Avec la niacine % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, PNDS-01 1,73 45.2 0,81 18.1 0,61 16.1 0,59 13,9 2.26 33,6 PNDS-02 2,86 35,9 1.26 30.9 1.27 22,7 0,73 15.2 3.03 37,7 PNDS-03 2.04 35,8 0,87 4.82 1.02 4.14 0,36 3.06 0,45 9,57 PNDS-04 2,56 32,9 1.15 21,8 1.12 18,6 0,77 17.2 3.37 36,5 PNDS-05 0,42 29.2 0,24 5.62 0,22 8.72 0,16 9.91 0,35 22.2 PNDS-06 1.8 28.1 0,4 16,8 0,62 15 0,42 9.27 2.28 38,4 PNDS-07 1.8 26,5 0,85 10.5 1.18 19,9 0,62 7.32 1.29 23,4 PNDS-08 0,98 22,8 0,86 7.28 1.55 10.2 0,14 5.98 0,59 13.3 PNDS-09 3,87 22.1 1.98 9.56 1,87 10.3 1.46 7.96 2,86 9,88 PNDS-10 4.46 21,9 2.57 13,6 4.04 17.1 2.28 11,9 0,71 25,7 PNDS-11 1.57 19.2 1.15 9.24 1.37 6.98 0,74 5.03 1.37 16 PNDS-12 1.06 16,7 0,66 4.38 0,7 4.74 0.99 6.36 1.14 4.73 PNDS-13 4.85 16,6 1.28 30,4 1.4 32,6 0,8 16,6 4.02 31 PNDS-14 2.08 16 0,68 15.4 0,64 16,5 1,97 10.2 1.25 20.11 PNDS-15 1.5 11,9 1.14 13.3 1.21 11.4 0,8 6.12 1.38 4.59 PNDS-16 1.82 10.4 2.04 9.59 1.24 5.62 0,91 5.38 1.31 7.61 PNDS-17 1.05 10.3 1.02 4.7 1,78 15.1 0,93 7,81 1.27 13 PNDS-18 1.11 8.76 0,54 3.68 0,61 3.51 1.01 5.03 1.02 6.69 PNDS-19 1 8.52 0,75 6,67 0,76 5,86 0,91 8.36 1.22 11,9 PNDS-20 3.54 7.92 3.78 12 3.56 5.81 3.28 8.28 3.44 12.3 PNDS-21 1,88 7.69 2.12 11.4 1,73 9.54 1,77 8.34 2.32 16,7 PNDS-22 1.64 7.17 0,35 5,75 0,56 13.2 0,14 4.33 1.23 17,8 PNDS-23 1,54 6.27 1.25 7.24 1.02 6.12 0,73 3.58 1.42 6.69 PNDS-24 0,53 6.22 0,52 4.49 0,91 5.57 0,54 4.01 0,65 10.5 PNDS-25 2,97 5.1 1,59 11 1,88 9 1.03 6.54 2.61 29.1 Tableau 1 : dépistage de la dyslipidémie des échantillons de sérum dans l’essai de plaque tableau montrent l’effet différentiel des médicaments hypolipidémiants. Par rapport aux contrôles sans drogue (colonnes 2, 3), des échantillons de sérum incubées avec l’ézétimibe (colonnes 4, 5), la lovastatine (colonnes 6, 7), simvastatine (colonnes, 8, 9) et niacine (colonnes 10, 11) ont montré des variations sur induire en forme linéaire des taux de cholestérol LDL et HDL formation de particules. ID de sérum Sans drogue Avec l’ézétimibe Avec la lovastatine Avec la simvastatine Avec la niacine % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, % Des particules de LDL linéaires, % Les particules HDL linéaires, PNAN-01 2.05 26,8 0,62 11,9 0,56 16,9 0,52 9.28 1.4 11,9 PNAN-02 1.35 26,3 1,68 21,8 2.59 23,6 0,79 6,92 2.16 29,7 PNAN-03 2.4 24,9 0,53 7.54 0,57 13,8 0.55 5.82 1.7 4.71 PNAN-04 1.99 21,5 1,54 9 h 45 1.56 8.25 0,31 3,74 2,88 20,8 PNAN-05 1,77 18,8 1.49 6.03 1,65 5.5 0,54 4.67 1.2 8.19 PNAN-06 1.12 15.2 0,67 4.42 2,68 13.3 0,5 2.37 1,54 16.3 PNAN-07 1.03 14.4 0,79 6.83 1.45 7,91 0,67 5.36 1.57 12 PNAN-08 0,98 14.3 0,88 4,48 2 7.1 0,19 2.66 1.02 18.1 PNAN-09 2,85 14.1 1.95 12.6 2.34 12,5 0,7 6.24 1,84 18,7 PNAN10 1.01 10.4 0,8 5.07 0,51 5.9 0,87 6.5 1.63 10,9 PNAN-11 0,92 12.4 0,21 9.94 0,29 3.31 0,29 6.52 0,58 10.4 PNAN-12 0,6 10.5 0,56 5.78 1.06 4.74 0,4 3.32 0,91 11,8 PNAN-13 1.25 10.3 0,45 3.79 0,67 6.53 0,27 3.17 0,8 6.28 PNAN-14 1.03 9,86 1.12 8.51 1.05 6.91 0,6 5.94 1.05 8.14 PNAN-15 2.28 8.1 1.93 10.4 2.14 8.86 1.56 6.84 2.31 8.61 PNAN-16 1.98 7.69 0,45 4.36 1 5.46 0,27 2.89 0,49 4.12 PNAN-17 1.72 6.72 0,75 14,8 0,74 9.26 0,49 5.58 1.98 12,8 PNAN-18 2.45 6.38 0,85 16,8 0,89 14.2 0,58 5.9 1.8 20,6 PNAN-19 1,67 5.12 0,58 8,63 0,65 5.7 0,64 8.8 1,88 2.08 PNAN-20 1.17 4.41 0,85 7.77 0,91 6.43 0,69 5.08 1.21 6.12 PNAN-21 0,31 4.18 0,48 6,95 0,19 5.09 0,15 2.1 0,29 5.93 PNAN-22 0,77 4.02 1.24 7.41 0,61 5.02 0,29 3,49 0,42 3.98 PNAN-23 0,4 1.25 0,75 6.25 0,88 5.91 0,9 5.06 0,82 6.71 PNAN-24 0,45 1.1 0,63 2.5 0.55 5.32 0,9 4.3 0,71 3.5 PNAN-25 0,36 1 0,73 2.4 0,66 5.1 0,82 4 0,7 3.4 Tableau 2 : dépistage des sérums témoins du même âge dans l’essai de plaque tableau montrent l’effet différentiel des médicaments hypolipidémiants. Par rapport aux contrôles sans drogue (colonnes 2, 3), des échantillons de sérum incubées avec l’ézétimibe (colonnes 4, 5), la lovastatine (colonnes 6, 7), simvastatine (colonnes, 8, 9) et niacine (colonnes 10, 11) ont montré des variations sur induire en forme linéaire des taux de cholestérol LDL et HDL formation de particules.

Discussion

En général, la distribution et les propriétés fonctionnelles des particules de cholestérol VLDL, LDL et HDL dans la circulation sanguine sont principalement déterminées par métabolique, génétique, épidémiologique, cellulaire et plasma facteurs22,23. Dans la présente étude, portant sur les effets des modificateurs de lipide drogues dans la mémoire tampon a révélé que les médicaments très lipophiles comme l’atorvastatine, lovastatine, simvastatine et ézétimibe induisaient une complexité de niveau supérieure sur la morphologie des particules de cholestérol par rapport à l’effet du niveau inférieur observé avec des médicaments hautement hydrophiles de la rosuvastatine et la fluvastatine. Ces résultats sont en accord avec notre étude précédente décrivant un effet non enzymatique mécanisme basé des statines dans la formation de particules de cholestérol LDL et HDL dans la mémoire tampon et le sérum échantillons21de modulation. En conséquence, les résultats de la présente étude a révélé un mécanisme non enzymatique d’action de l’ézétimibe, niacine, fibrate et acides gras oméga-3 les médicaments qui peuvent jouer un rôle direct dans la modulation de la formation de particules de cholestérol. Il est possible que les interactions entre les médicaments et les agrégats de cholestérol conduit à l’Assemblée de particules de cholestérol de grande taille qui sont 2-60 µm2, présentant des morphologies brin globuleux et linéaire.

En outre, les résultats obtenus à l’aide de particules lipoprotéiques purifiée suggèrent des interactions entre les agrégats de cholestérol et facteurs plasmatiques, y compris les VLDL, LDL et HDL des protéines qui peuvent altérer les compositions et les propriétés morphologiques du cholestérol particules. Les résultats de traitement de drogue impliquant les particules lipoprotéiques purifiée ont indiqué un effet de drogue de niveau supérieur sur la formation de particules de VLDL par rapport à leur effet observé sur la formation de particules de cholestérol LDL. Les médicaments de la lovastatine, simvastatine et ézétimibe servaient comme pro-médicaments et les doses dans les essais peuvent être plus élevées que les concentrations physiologiques.

Fait intéressant, dépistage des échantillons de sérum ont montré des variations des effets du médicament sur la modification des profils de formation de particules de cholestérol VLDL, LDL et HDL, en particulier leurs effets sur les formations de linéaire en forme de particules de LDL et HDL. Ces drogues a induit une réduction sur le linéaire en forme de formation de particules de cholestérol LDL et HDL dans la dyslipidémie et de sérums normaux appariés selon l’âge. Les effets des médicaments observés sur la réduction de la formation de particules en forme linéaire était plus élevée chez simvastatin ezetimibe, lovastatine et niacine. L’identification des particules de cholestérol avec des morphologies de brin globuleux et linéaire dans les échantillons de sérum normal et les dyslipidémies donne à penser que les particules avec des morphologies semblables peuvent se former dans des conditions in vivo . Des études antérieures ont identifié la présence du disque et de cristaux aciculaires de cholestérol dans les plaques d’athérosclérose de l’homme et ApoE– / – et LDLR– / – souris modèles24,25,26 ,27,28.

Les particules HDL circulant dans le sang existent comme un mélange hétérogène et le niveau de particules HDL de petite ou de grande envergure ainsi que de l’activité fonctionnelle sont des facteurs importants pour exercer leur effet cardioprotecteur via le transport du cholestérol inverse sentier29,30. Des études récentes ont mis en évidence l’importance d’identifier des HDL cholestérol particule sous-fractions pour élucider leur rôle dans plusieurs fonctions biologiques telles que l’efflux de cholestérol, anti-inflammatoire, antithrombotique et antioxydantes31 . En outre, un certain nombre d’études ont signalé l’effet du traitement hypolipidémiant en augmentant un faible à modérée des taux de HDL dans le plasma1,5,21. Par conséquent, les résultats de cette étude apportent un nouvel éclairage sur les caractéristiques morphologiques des particules de cholestérol. Notamment, la détection d’un niveau plus élevé de particules en forme linéaires de cholestérol HDL dans les échantillons de sérum de sujets de dyslipidémie suggère qu’ils pourraient être le biomarqueur fiable pour diagnostic et évaluation des effets de la modification des lipides médicaments chez des patients. Toutefois, outre enquête est requise à l’aide de grands échantillons cliniques pour mieux comprendre les particules de cholestérol avec des morphologies distinctes et leur association aux MCV.

Dans l’essai de tableau de plaque pour examiner l’effet des drogues sur l’assemblage de particules de cholestérol, nous avons utilisé 2 µg de fluorescence étiqueté agrégats de cholestérol et 5 µgof de chaque drogue parce que : (1) médicaments competitivement lient à deux fluorescence étiqueté cholestérol et lipides endogènes présents dans les échantillons de sérum ; (2) de chaque échantillon, nous avons acquis des particules de cholestérol de 5 000 à 10 000 qui sont assemblés en grandes tailles et de formes allant de ~ 2-60 µ2; (3) nous avons observé une grandes variations de la réaction aux médicaments dans les échantillons de sérum incubé avec les médicaments (doses 300 ng à 5 µg) et ~ 1 à 5 % d’entre eux incubés avec de fortes doses ont montré aucun changement détectable dans le profil de la formation de particules de cholestérol ; et (4) l’interaction entre les agrégats de cholestérol et de médicaments hypolipidémiants est médiée par un processus non enzymatiques. Par conséquent, les concentrations des réactifs utilisés dans l’essai peuvent être supérieures à son niveau physiologique.

En conclusion, nous avons démontré avec succès les avantages d’un in vitro d’imagerie méthode décrite dans la présente étude pour déterminer l’effet d’un large spectre de médicaments hypolipidémiants sur modulant la morphologie et la composition du cholestérol particules. L’approche de visualiser et de quantifier la morphologie des particules lipidiques en employant une constellation d’algorithmes d’analyse image peut aider les deux le diagnostic d’athérosclérose et d’évaluer les résultats du traitement hypolipidémiant chez les patients.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par une recherche Plaxgen subvention octroyée à la SM (PLX-1008). Nous remercions Palo Alto Medical Research Foundation Research Institute pour la collecte des échantillons de sérum de sujets à l’athérosclérose l’approbation de l’IRB.

Materials

TopFluor fluorescent cholesterol Avanti Polar lipids store 100 µl aliquots at -20 °C
simvastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
lovastatin (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
rosuvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
atorvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
fluvastatin Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
ezetimibe (pro-drug) Cayman Chemicals store 100 µl aliquots at -20 °C
Niacin MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
fibrate MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
omega-3 fatty acid MilliporeSigma store 100 µl aliquots at -20 °C
purified VLDL proteins/particles Lee Bio
purified LDL proteins/particles Lee Bio
purified HDL proteins/particles Lee Bio
Human age-matched serum Dx Biosamples
Human atherosclerosis serum Bioserve
Human normal serum Stanford Blood center
LDL measurement reagent pack Roche Diangostics
HDL measurement reagent pack Roche Diangostics
Total cholesterol measurment Roche Diangostics
96-well microtitre plates
Triglycerides measrument Roche Diangostics
Amnis Imaging Flow cytometer Amnis Inc
IDEAS image analysing software Amnis Inc
Chemistry Analyzer-1, ChemWel 2902 Awarness Technology
Chemistry Analyzer-2, Intergra 400 Roche Diangostics
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Madasamy, S., Liu, D., Lundry, J., Alderete, B., Kong, R., Robinson, J. P., Wu, A. H., Amento, E. P. Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles. J. Vis. Exp. (129), e56596, doi:10.3791/56596 (2017).
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