İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi
Summary
Biz dinamik spinal vasküler değişiklikler yetişkin Sprague-Dawley Sıçanlarda contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip izlemek için iki farklı floresan boyalar kullanarak yöntemi Imaging bir vivo tanıtmak.
Abstract
Medulla Spinalis Yaralanmalarında (SCI) önemli vasküler bozulma sitesinde yaralanma neden olur. Vasküler patoloji SCI hemen sonra ortaya çıkar ve akut yaralanma aşaması boyunca devam eder. Aslında, endotel hücreleri ilk contusive FK sonra ölen görünmektedir Kan-spinal kord bariyer (BSCB), geçirgenliği artmıştır dahil erken vasküler olayı vasogenic ödem ikna etmek ve karmaşık yaralanma mekanizmaları tarafından neden olduğu zararlı ikincil yaralanma olayları katkıda. Bu nedenle, histolojik ve Fonksiyonel bozukluklar bilm sonra katkıda ikincil yaralanma cascades azaltmak için anahtar bir strateji olabilir vasküler bozulma hedefleme Önceki çalışmalar çoğunlukla öldükten sonra örnekleri üzerinde gerçekleştirilen ve vasküler ağ dinamik değişiklikleri yakalamak koyamadık. Bu çalışmada, akut vasküler dinamik değişiklikler contusive FK takip izlemek için bir vivo içinde duo-renk İki fotonlu görüntüleme yöntemi geliştirdik Bu yaklaşım kan akımı, damar çapı ve çeşitli sitelerde aynı fare öncesi ve sonrası yaralanma diğer vasküler patolojiler tespit sağlar. Genel olarak, bu yöntem vasküler dynamics soruşturma için mükemmel bir mekan sunar.
Introduction
Travmatik spinal kord yaralanması (SCI) motor, duyusal ve otonom fonksiyon bozukluğu için önde gelen ortak bir yaralanma olduğunu. Göre ulusal omurilik yaralanma istatistik Merkezi (NSCISC) 2016 yılında, yaklaşık 282,000 kişi ise % 69 esas olarak trafik kazaları nedeniyle etkilenen veya1düşüyor. Bu hastalar genellikle yoğun bakım gerektirir; Ancak, etkili bir tedavi yok şu anda mevcuttur. Bu nedenle, yeni etkili stratejiler SCI karşı acilen ihtiyaç vardır.
SCI esas olarak iki aşamada ayrılmıştır: birincil yaralanma ve ikincil yaralanma. Birincil yaralanma etkisi2iltihap, hücre Apoptozis ve giderek yol kalan aksonlar, demiyelinizasyon gibi ikincil yaralanma olayların ardından, yerinde Hemorajik nekroz neden fiziksel hakaret oluşur için genişleme morfolojik ve fonksiyonel açıkları3,4,5,6. Kanama, yaralanma, SCI7,8Akut Faz hemen bir vasküler bozulma gösteren ilk görünür işarettir. Hastaların kurtarma erken vasküler hasar azaltmaya yönelik bir nöroprotektif strateji geliştirmek olabilir ama bu olayların erken sonrası yaralanma vasküler patofizyolojik mekanizması daha iyi anlaşılmasını gerektirir.
Spinal kord damarlara çalışmaya çeşitli yöntemlerle önceki çalışmalarda rağmen önemli kısıtlamalar kalır. En paylaşılan dezavantajı sadece öldükten sonra örnekleri, örneğin, hidrojen izni9, autoradiography10, microangiogram8, vasküler korozyon atmalarını11ve immünhistokimya12 okuyor ,13. Lazer Doppler Flowmetry spinal kord kan akışı14invaziv olmayan gerçek zamanlı izleme sağlasa da, vasküler sistem arasında ayırt etmek ve vasküler morfolojik değişiklikleri algılamak değiştiremiyor. Dinamik kontrast-artırılmış MRI (DCE-MRI) ayrıca noninvaziv, ancak düşük çözünürlüklü görüntüleri oluşturur ve bir pahalı altyapı15gerektirir.
Her ne kadar 2-Foton kullanarak Imaging vivo içinde tarama mikroskobu lazer (2 P-LSM) korteks16,17,18vasodynamics eğitimi için geliştirilmiştir, çalışmalar sınırlı sayıda var sonra contusive bir yaralanma daha iki nedenden dolayı zor gösterdiği vasküler değişiklikler bilm Tang ve ark. takip hemisection model19ama görüntüleme lezyon sitedeki kenarında kan akımı değişiklikleri göstermiştir. İlk olarak, bir geleneksel cam optik pencere yaralanma site üzerinde olmaz mekanik etkisi sürdürmek ve görüntüleme için işlevsel kalır. İkincisi, izleyici nedeniyle parankimi içine kaçağı kanama ile sonrası yaralanma görüntülemede zorluk oluşturur.
Burada aynı bireysel damarları öncesi ve sonrası yaralanma zaman noktalarda görüntüleme sağlar bir roman duo-renk görüntüleme yöntemi mevcut. Buna ek olarak, contusive Bilimler takip vasküler dinamik değişiklikleri zamansal kayma profilini sağlar Ayrıca birden çok sonrası uzatma süresi noktalarda görüntüleme için potansiyele sahiptir. Bu iletişim kuralı doğrudan nörovasküler etkileşim çalışmaya Transjenik hayvanlar için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geleneksel teknikleri öldükten sonra örnekleri damar yapısı değişikliklere büyük ölçüde sınırlı olduğundan damar çalışmalar SCI takip için bir meydan okuma teknik kısıtlamadır. Yukarıda açıklanan yöntemi Imaging bu roman vivo içinde kan akışı ve ilgili parametreleri (hız ve damar çapı) 2 P-LSM canlı fareler kullanarak dinamik ölçüm sağlar. Ayrıca aynı setler halinde gemiler contusive FK takip farklı zaman noktalarda tekrarlanan muayene sağlar Önceki 2-Foton mikroskobu görüntüleme teknikleri sonrası travma vasküler yapılar nedeniyle tek bir izleyici kaçağı yakalamak koyamadık. Bizim duo renk tasarımı travmatik modelleri için dinamik vasküler görüntüleme sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem esnekliğini bilm takip akut vasküler değişiklikler kayma geçici bir profil oluşturmak için bir fırsat sağlar
Bizim içinde vivo duo-renk görüntüleme yönteminde çeşitli kritik adımlar vardır. İlk olarak, omurilik hızlandırılmış görüntüleme, özellikle solunum hareket artefaktı azaltma önce fiziksel istikrarı sağlamak için esastır. Biz biraz istikrar sırasında omurga omur yüksekliğini yükseltmek spinal kelepçeler şeklinde tasarlanmış. Böylece omurilik nefes hayvan birleştiriliyor hareketi olabilir (şekil 1 d-F, 2B) büyük ölçüde azalır. Bu omurilik önce görüntüleme her oturum başına istikrar kontrol etmek için tavsiye edilir. Spinal kord istikrar elde etmek başarısız olursa, hizalama ve darlık omurilik kelepçeler, düzeltmenin yapılması gerektiğini. İkinci, periferik doku (kemik, kas katmanı ve cilt) görüntüleme penceresinin içine kanama görünümü kirlenme riski. Pürüzsüz bir görüntü oturum için aspirasyon ve doku yapıştırıcı tutkal çevreleyen doku etkili önlenmesi için uygulanmalıdır. Üçüncü olarak, seçtiğimiz floresan boyalar albumin (66 kDa), ana yüksek molekül ağırlıklı kan plazma protein olan benzer bir boyutu var. Homeostatik koşullar altında boyaları büyük ölçüde albümin28benzer gemi içinde muhafaza. Yaralanma sonra boya kesintiye endotel yapının içinden geçti ve damarlara (şekil 3F-G) çevre alanında önemli bir artış floresan yoğunluğu neden parankimi içine sızdırılmış. Buna ek olarak, dış juguler ven Kateterizasyonu neden seçtiğimiz iki nedeni vardır. İlk olarak, deneme herhangi bir zamanda teslimat sürekli erişilebilir bir yol sağlayabilir. İkinci olarak, bu gelecekteki tedavi enjeksiyon için bir yol olarak kullanılabilir.
Bizim içinde vivo duo-renk yöntemi travmatik vasküler görüntüleme çalışmaları için yeni bir yer sağlamak mümkün olsa da, bazı uyarılar bu tekniği ile ilgili olarak ele alınmalıdır. Şu anda, bu tekniği 2 saat puan (temel ve 1 sonrası yaralanma zaman puan), vasküler değişiklikler değerlendirmek için tasarlanmıştır, ancak ek floresan boyalar ve kanallar varsa birden fazla zaman puan için geçiş yapmak için uygun olduğunu. Çeşitli çalışmalarda kronik intravital görüntüleme için implante cam pencere kullanarak olmakla birlikte, hiçbiri-in onları travma olabilir19,29,‘30dan sonraaynı gemide temel bilgiler sağlayabilir, 31,32. Bu çalışmalar, bir no-cam pencere bizim penceredir. Bu öncesi ve sonrası yaralanma görüntüleme için uygundur, ama uzun vadeli gözlem için pencereyi yeniden kurmak için zor olabilir. Bizim gelecekteki araştırmalar için kronik düşsel teknik iyileştirme üzerinde çalışıyor. Vasküler sistem çeşitli gemi türleri (arter, ven ve kılcal damar) oluşmaktadır ve her morfoloji ve işlev özellikleri farklıdır. Görüntüleme sırasında gemi türleri arasında farklılaşma vasküler değişiklikler açık bir desen alay için yardımcı olabilir. Yukarıdaki Protokolü morfoloji ve hız dayalı gemileri tespit gözlemci bağlıdır; Ancak, bir arter özel boya gemi türleri33arasında daha kesin bir sınıflandırma vermek için kolayca eklenebilir.
Bu teknik sadece contusive üzerinde Değerlendirmeler ile sınırlıdır ve ezilme hasarı ve radyasyon yaralanma, gibi diğer travmatik modeller, ancak de BSCB bozulma üzerinde odaklanan derslerine de vasküler geçirgenliği değişir. SCI yanı sıra, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve Multipl skleroz (MS) gibi diğer nörodejeneratif hastalıkların takip vasküler değişiklikler çalışma için kullanılan olabilir. Ayrıca, dinamik nörovasküler etkileşim çalışması transgenik bir hayvan modeli için transferrable olabilir. Güçlü tarama aracı olarak, gelecek çalışmalar Medulla Spinalis Yaralanmalarında tedavisinde etkinliğini değerlendirmek için burada açıklanan görüntüleme tekniği kullanmak olabilir.
Sonuç olarak, in vivo duo-renk yöntemi zamansal kayma vasküler profil karakterizasyonu için idealdir dinamik vasküler değişiklikleri değerlendiriliyor ve tedavilere için eleme için bir güvenilir, gerçek zamanlı, in vivo yaklaşım araçtır ikincil hasarlar bilm takip azaltmak
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Merit inceleme Ödülü I01 BX002356 US Department of Veterans Affairs, Craig H Neilsen Vakfı 296749, Indiana omurilik ve beyin hasarı Araştırma Vakfı () tarafından desteklenen yapıldı. ISCBIRF) Indiana devlet Sağlık Bakanlığı (019919) ve Mari Hulman George Endowment fon.
Materials
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| 1ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
Referencias
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
- Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
- Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
- Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
- Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
- Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
- Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
- Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
- Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
- Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
- Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
- Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
- Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
