فيفو في الأسلوب الثنائي-اللون لتصوير الأوعية الدموية ديناميات بعد إصابة الحبل الشوكي كونتوسيفي
Summary
نحن نقدم في فيفو التصوير أسلوب استخدام الأصباغ الفلورية مختلفة اثنين إلى تعقب تغييرات الأوعية الدموية العمود الفقري الديناميكي بعد إصابة حبل الشوكي كونتوسيفي في الفئران سبراغ داولي الكبار.
Abstract
إصابات النخاع الشوكي (علوم) يسبب اضطرابا والأوعية الدموية في الموقع الإصابة. أمراض الأوعية الدموية يحدث فورا بعد الخيال ويستمر طوال مرحلة الإصابة الحادة. وفي الواقع، تظهر خلايا بطانية لتكون الأول من يموت بعد عشر كونتوسيفي الحث على ذمة فاسوجينيك أحداث الأوعية الدموية المبكر، بما في ذلك زيادة نفاذية الحاجز الحبل الشوكي الدم (بسكب)، وتسهم في أحداث الضرر الثانوي ضارة بسبب آليات الإصابات المعقدة. تستهدف عرقلة الأوعية الدموية، ولذلك، يمكن أن تكون استراتيجية رئيسية للحد من الضرر الثانوي الشلالات التي تسهم في ضعف في غذائها والوظيفية بعد عشر دراسات سابقة أجريت في معظمها على عينات تشريح الجثة وغير قادر على التقاط التغيرات الدينامية لشبكة الأوعية الدموية. في هذه الدراسة، وقد وضعنا في فيفو ديو-لون اثنين-فوتون تصوير وسيلة لرصد التغيرات الدينامية الأوعية الدموية الحاد بعد عشر كونتوسيفي يسمح هذا النهج للكشف عن تدفق الدم وقطر السفينة، وأمراض الأوعية الدموية الأخرى في مواقع مختلفة من الفئران نفس ما قبل وما بعد الإصابة. وبوجه عام، يوفر هذا الأسلوب مكاناً ممتازا للتحقيق في ديناميات الأوعية الدموية.
Introduction
إصابات النخاع الشوكي الرضية (علوم) إصابة مشتركة مما يؤدي إلى الأضرار بالوظيفة الحركية والحسية والمتمتعة بالحكم الذاتي. وفقا للوطنية النخاع الشوكي إصابة الإحصائية مركز (نسسيسك) في عام 2016، حوالي 282,000 شخص تأثرت بينما 69% منهم كانت أساسا بسبب حوادث المرور أو يقع1. هؤلاء المرضى غالباً ما تتطلب العناية المركزة؛ لا يوجد علاج فعال غير متوفرة حاليا. ولذلك، هناك حاجة ماسة استراتيجيات فعالة جديدة نحو الخيال.
الخيال العلمي وينقسم أساسا إلى مرحلتين: الإصابة الأولية والإصابة الثانوية. الضرر الأساسي يشمل الإهانة المادية يسبب نخر النزفية في موقع الأثر2، تليها سلسلة من أحداث الضرر الثانوي، مثل التهاب واستموات الخلايا وديمييلينيشن من محاور عصبية المتبقية، أن يقود تدريجيا للتوسع في العجز المورفولوجية والوظيفية3،4،،من56. نزف هو أول بادرة تظهر الإصابة، مما يدل اضطراب الأوعية الدموية فورا في المرحلة الحادة من علوم7،8. محصن استراتيجية تهدف إلى الحد من الأضرار والأوعية الدموية المبكر يمكن تحسين استرداد المرضى، ولكن هذا يتطلب فهم أفضل للآلية الفيزيولوجية المرضية للأحداث الأوعية الدموية بعد الإصابة المبكرة.
وعلى الرغم من الدراسات السابقة باستخدام أساليب مختلفة لدراسة المفرج الحبل الشوكي، تظل القيود الهامة. عيب مشترك آخر يدرس فقط عينات تشريح الجثة، وعلى سبيل المثال، إزالة الهيدروجين9و autoradiography10، ميكروانجيوجرام8، وتآكل الأوعية الدموية يلقي11وإيمونوهيستوتشيميستري12 ،13. على الرغم من أن يوفر الليزر دوبلر Flowmetry موسع في الوقت الحقيقي رصد تدفق الدم الحبل الشوكي14، أنه غير قادر على التفريق بين نظم الأوعية الدموية والكشف عن التغيرات المورفولوجية الأوعية الدموية. الرنين المغناطيسي الحيوي تعزيز التباين (DCE-التصوير بالرنين المغناطيسي) أيضا موسع، ولكن يقوم بإنشاء صور ذات دقة منخفضة ويتطلب عامل تكلفة البنية التحتية15.
ورغم أن في فيفو التصوير باستخدام 2-فوتون بالليزر الفحص المجهري (2 ف-LSM) قد وضعت لدراسة فاسوديناميكس بقشرة16،،من1718، لديها عدد محدود من الدراسات أظهرت التغيرات الأوعية الدموية بعد عشر تانغ et al. أظهرت التغيرات في تدفق الدم في الحافة من موقع الآفة في نموذج هيميسيكشن19، ولكن التصوير بعد إصابة كونتوسيفي أكثر صعوبة لسببين. أولاً، لن نافذة ضوئية زجاج تقليدية عبر موقع الإصابة إدامة تأثير الميكانيكية وتبقى وظيفية للتصوير. الثانية، وتسرب الراسم إلى حمة نظراً لنزيف يخلق صعوبة مع تصوير ما بعد الإصابة.
نقدم هنا طريقة تصوير رواية ديو-لون، مما يتيح التصوير نفس السفن الفردية في نقاط زمنية ما قبل وما بعد الإصابة. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يوفر لمحة الزمانية مكانية للتغيرات الدينامية الأوعية الدموية بعد عشر كونتوسيفي كما أن لديها الإمكانات لتصوير في نقاط متعددة في وقت ما بعد الإصابة. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها مباشرة على الحيوانات المحورة وراثيا لدراسة التفاعل نيوروفاسكولار.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحد واحد للدراسات الأوعية الدموية عقب الخيال هو التقادم التقني نظراً لأن التقنيات التقليدية مقيدة إلى حد كبير إلى التغييرات بنية الأوعية الدموية في عينات تشريح الجثة. هذه الرواية في فيفو التصوير الطريقة الموصوفة أعلاه يمكن القياس الحيوي من تدفق الدم والمعلمات ذات الصلة (السرعة وسفينة القطر) باستخدام 2 ف-LSM في الفئران الحية. كما أنه يتيح فحص متكررة في نفس مجموعات من السفن في نقاط زمنية مختلفة بعد عشر كونتوسيفي تقنيات التصوير المجهري 2-فوتون السابقة كانت غير قادر على التقاط هياكل الأوعية الدموية الصدمات النفسية بسبب تسرب التتبع واحد. لدينا تصميم الألوان الثنائي يتيح تصوير الأوعية الدموية الحيوية لنماذج الصدمات. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر مرونة هذا الأسلوب فرصة لإنشاء تشكيل جانبي الزمانية مكانية للتغيرات الوعائية الحادة بعد عشر
هناك عدة خطوات حاسمة في جهودنا في فيفو ديو-التصوير أسلوب لون. أولاً، أنه أمر أساسي لضمان الاستقرار المادي للحبل الشوكي قبل الوقت الفاصل بين التصوير، ولا سيما تخفيض التنفس الحركة قطعة أثرية. لقد قمنا بتصميم شكل المشابك العمود الفقري لزيادة ارتفاع فقرة العمود الفقري قليلاً أثناء التثبيت. وهكذا يمكن أن تكون حركة الحبل الشوكي مضاهاة للحيوان التنفس تقلص إلى حد كبير (الشكل 1-F، 2B). من المستحسن التحقق من استقرار الحبل الشوكي قبل بداية كل دورة التصوير. في حالة فشل النخاع الشوكي لتحقيق الاستقرار، ينبغي التعديل المحاذاة وضيق من المشابك الحبل الشوكي. الأنسجة المحيطية، والثاني (العظام والعضلات طبقة الجلد) نزيف في نافذة التصوير يمكن أن خطر التلوث من طريقة العرض. لجلسة تصوير سلس، ينبغي تطبيق الغراء لاصقة جيلفوام والأنسجة للأنسجة المحيطة للوقاية الفعالة. ثالثا، لقد الأصباغ الفلورية نختار حجم مماثل كالزلال (كاتشين 66)، وهو بروتين بلازما الدم الرئيسية عالية الوزن الجزيئي. تحت شروط التماثل الساكن، أبقى الأصباغ إلى حد كبير داخل السفينة مماثلة كالزلال28. بعد الإصابة، الأصباغ تم تمريرها من خلال هيكل غشائي تعطلت وتسربت إلى حمة، مما تسبب كثافة فلورسنت زيادة كبيرة في منطقة هامشية من المفرج (الرقم 3F-ز). وبالإضافة إلى ذلك، هناك سببان لماذا علينا أن نختار قسطرة الوريد الخارجي. أولاً، يمكن أن توفر طريقا موجوداً دائماً للتسليم في أي وقت من هذه التجربة. وثانيا، يمكن استخدامه كطريق لحقن العلاج مستقبلا.
على الرغم من أن لدينا أسلوب لون ديو في فيفو قادرة على توفير مكان رواية للصدمة دراسات تصوير الأوعية الدموية، يجب أن تعالج بعض المحاذير المتعلقة بهذا الأسلوب. حاليا، تم تصميم هذه التقنية تقييم التغيرات الأوعية الدموية في نقاط زمنية 2 (خط الأساس ونقطة واحدة في وقت ما بعد الإصابة)، ولكن من الممكن للتبديل إلى نقاط زمنية متعددة إذا كانت تتوفر صبغات الفلورسنت إضافية والقنوات. على الرغم من أن هناك العديد من الدراسات باستخدام نافذة زجاجية مزروع لتصوير إينترافيتال المزمن، أيا منها يمكن أن توفر معلومات خط الأساس على متن السفينة نفسها بعد الإصابات الرضية19،،من2930، 31،32. وخلافا لهذه الدراسات، ونافذة لدينا نافذة زجاجية لا. يعد هذا ملائماً لتصوير ما قبل وما بعد الإصابة، ولكن قد يكون تحديا لإعادة إرساء إطار للمراقبة طويلة الأجل. ابحاثنا مستقبلا هو العمل على تحسين التقنية لتصوير المزمنة. ويتألف نظام الأوعية الدموية للعديد من أنواع السفن (الشريان والوريد والشعرية) وكل منها يختلف في جوانب مورفولوجيا ووظيفة. يمكن أن يساعد التفرقة بين أنواع السفن أثناء تصوير ندف على نمط واضح من تغييرات الأوعية الدموية. يعتمد البروتوكول أعلاه على المراقب تحديد السفن التي تستند إلى مورفولوجيا والسرعة؛ ومع ذلك، يمكن إضافة صبغة خاصة بالشريان بسهولة إعطاء تصنيف أكثر تحديداً بين سفينة أنواع33.
هذه التقنية المحدودة للأنصبة المقررة على كونتوسيفي ونماذج مؤلمة أخرى، مثل سحق الأذى والضرر الإشعاعي، ليس فقط ولكن أيضا في الدراسات التي تركز على تعطيل بسكب، نفاذية كذلك الأوعية الدموية تغيير. وإلى جانب الخيال، يمكن استخدامه لدراسة التغيرات الأوعية الدموية عقب الأخرى أمراض الأعصاب مثل التصلب العضلي الجانبي (المرض) والتصلب المتعدد (MS). وعلاوة على ذلك، يمكن أن يكون التحويل إلى نموذج حيوانات المحورة وراثيا لدراسة التفاعل الديناميكي نيوروفاسكولار. يمكن أن تستخدم الدراسات المستقبلية كأداة فحص قوية، تقنية التصوير الموضحة هنا لتقييم فعالية العلاج لإصابات النخاع الشوكي.
وفي الختام، في فيفو الأسلوب الثنائي-لون هو أداة نهج موثوق بها، في الوقت الحقيقي، في فيفو لتقييم التغيرات الدينامية في الأوعية الدموية، ومثالي لتوصيف الشخصية الأوعية الزمانية المكانية والكشف عن علاجات تقليل الأضرار الثانوية بعد عشر
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جزئيا NS059622 المعاهد الوطنية للصحة، NS073636، ووزارة الدفاع كدمرب W81XWH-12-1-0562، تستحق الاستعراض جائزة I01 BX002356 من إدارة شؤون المحاربين القدامى الأمريكي، كريغ ح نيلسون مؤسسة 296749، إنديانا الحبل الشوكي و “مؤسسة البحوث إصابة المخ” ( إيسكبيرف) إنديانا إدارة الدولة في الصحة (019919)، وماري جورج هولمان أموال الهبات.
Materials
| Purdue Products Betadine Surgical Scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | Skin sterilization |
| Ketamine (87.7 mg/kg)/Xylazine (12.3 mg/kg) | Patterson Veterinary | 07-881-9413, 07-890-5745 | Anesthetic agent |
| Buprenorphine(0.03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Pain relief agent |
| Carprofen | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | Non-steroidal anti-inflammatory drug |
| Dukal Gauze Sponges | Fisher Scientific | 22-415-490 | Skin sterilization |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | Skin sterilization |
| Artificial Tears Eye Ointment | Webster Veterinary | 07-870-5261 | Prevent drying eyes |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 1006015 | |
| Rhodamine B isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | R9379 | Average mol wt 70kDa |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | Average mol wt 70kDa |
| Instrument Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | for sterilizing surgery tool |
| Spine stabilizer set | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Vetbond | 3M Animal Care Products | 1469SB | Tissue adhesive Glue |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | Stop bleeding |
| Noyes Spring Scissors | F.S.T | 15013-12 | |
| Fine Forceps- Dumont #5 | F.S.T | 11254-20 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | laminectomy |
| Surgical Retractor | Fine Science Tools | 17005-04 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | skin cut |
| Scalpel Blade #15 | Royal-Tek | BS2982 | skin cut |
| micro angled scissors | World Precision Instruments | 500260 | Can be from any vendor |
| 3-0 vicryl sutures | Ethicon | J393H | Can be from any vendor |
| 1ml syringe | Henke Sass Wolf | 4010.200.V0 | Can be from any vendor |
| 21 gauge needle | BD | 305165 | Can be from any vendor |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | Can be from any vendor |
| Two-photon Laser Scanning Microscope | Bruker Fluorescence Microscopy | ||
| LISA device | Custom Manufactured from Norton Neuroscience Institute | Contact Y. Ping Zhang for details. (yipingzhang50@gmail.com) |
|
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| HCImage Live | Hamamatsu Corporation | Imaging software | |
| PrairieView | Prairie Technologies/Bruker | Two-photon imaging software | |
| ImageJ | Image analysis software | ||
| Matlab statistics toolbox | The MathWorks, Inc. | https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitle | Image analysis software |
Referencias
- National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
- Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
- Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
- Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
- Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
- Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
- Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
- Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
- Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
- Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
- Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
- Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
- Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
- Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
- Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22 (2006).
- Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590 (2012).
- Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691 (2015).
- Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
- Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149 (2015).
- Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
- Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932 (2013).
- Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
- Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228 (2014).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760 (2012).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
