Bağışıklık hücreleri tek siyatik sinirleri ve Dorsal kök gangliyon üzerinden tek bir fare kullanarak Akış Sitometresi Analizi
Summary
Kantitatif analiz fare siyatik sinir içinde hücre içeriğinin doku kıtlığı nedeniyle zordur. Bu iletişim kuralı doku sindirim ve sinir bağışıklık hücre gruplarından bireysel farelerin Akış Sitometresi Analizi için yeterli hücre sağlar hazırlık için bir yöntemi açıklar.
Abstract
Periferik sinir sistemi (PNS) sinir yerleşik bağışıklık hücreleri sağlıklı bir sinir içinde nöronal bütünlüğünü korumak için gereklidir. PNS bağışıklık hücreleri yaralanma ve hastalık, sinir fonksiyonu ve rejenerasyon kapasitesini etkileyen etkilenir. Nöronal bağışıklık hücreleri yaygın olarak ayirt (Eğer) tarafından incelenir. Eğer sinir, bağışıklık hücreleri konumunu belirleyen temel sadece yarı nicel olup yöntemi aynı anda analiz edilebilir işaretleri sayısı ve yüzey ifade derecesi ile sınırlı olup olmadığını tamamlayın. Bu çalışmada, Akış Sitometresi lökosit infiltrasyonu siyatik sinir veya dorsal kök ganglions (DRGs) bireysel farelerin kantitatif analiz için kullanıldı. Tek hücre analizi DAPI kullanılarak gerçekleştirilmiş ve çeşitli proteinler aynı anda yüzey ya da hücre içi ifade için analiz edildi. Bu protokole göre tedavi edildi her iki siyatik sinirleri bir fareden ≥ 30.000 tek çekirdekli olayları oluşturuyordu. Lökosit siyatik sinir, CD45, ifade tarafından belirlenen oranda yaklaşık %5 Toplam Hücre içeriğinin siyatik sinir ve DRG yaklaşık % 5-10 oldu. Her ne kadar bu iletişim kuralı öncelikle PNS içinde bağışıklık hücre nüfus odaklanır, aynı anda bir sayı işaretlerinin ölçmek için Akış Sitometresi esnekliğini diğer hücre nüfusları Schwann hücreleri, perisitlerden gibi sinir içinde mevcut anlamına gelir , fibroblastlar ve endotel hücreleri, de analiz bu yöntemi kullanarak. Bu yöntem bu nedenle PNS, neurotoxicology ve genetik modellerini nöropati veya diyabet gibi kronik hastalıkları gibi sistemik etkileri eğitimi için yeni bir yol sağlar.
Introduction
PNS dolaşımdan girin bağışıklık hücreleri CD45 ve CD11b, ifade tarafından tanımlanan sinir bütünlüğünü korumak ve her iki rejenerasyon ve dejenerasyonu1‘ rol için yardım et. Makrofajlar (CD68 onların ifade Mouse tarafından tanımlanan) daha fazla MHC ifade bir enflamatuar fenotip doğru eğilmiş onların yüzey (M1) Sınıf II ve CD86 veya daha fazla hücre içi CD206 bir anti-inflamatuar fenotip doğru ifade (M2)2 . Makrofaj fenotip eğriltme3sinyal, patojenler (M1) karşı savunma makrofajlar ve doku rejenerasyonu (M2) rolünde farklı görevler yansıtan Akt üzerinden düzenlenmiş bir dinamik işlemidir. Yaralı bir sinir rejenerasyon ilk sinir4,5ve anti-inflamatuar makrofajlar tarafından fagositoz miyelin enkaz gerektirir (CD68+CD206+) M2 makrofajlar axon akıbet tanıtmak için gösterilmiştir PNS6. İşe Alım veya makrofajlar PNS için azaltılmış veya Engelli fagositoz kapasiteli Engelli rejenerasyon ve sinir bütünlük bakımından sonuçlanabilir. MHC sınıf II, ifade inflamatuar M1 makrofajlar M2 makrofajlar fagositoz daha az yetenekli ve nöronal inflamasyon çeşitli nörodejeneratif hastalıkları7patogenezinde karıştığı.
Sinir yerleşik bağışıklık sistemi hasarı sonucu olarak meydana gelen değişiklikler kantitatif, CD45 kaybına tezahür olabilir+ lökosit (veya artmıştır infiltrasyon CD45+ lökosit olgu iltihabı), veya nitel, gibi makrofaj fenotip m2 M1 fenotip için değişti. PNS bağışıklık hücreleri geleneksel olarak donmuş bölümleri veya malzeme8parafin gömülü kullanarak Eğer aracılığıyla analiz edilmiştir. Eğer ilgi hücrelerinin yerelleştirme belirlemek için gereklidir. Ancak, eğer kez miktar kullanarak nispeten az sayıda dar bir bölümü olan miktar güvenilmez ve seçim önyargı karşı savunmasız hale doku, Hücre sayımı dayanır. Makrofaj fenotip belirlenmesi en az en az iki işaretleri, özellikle CD206 ve MHC gerektirir iken bağışıklık hücreleri belirli alt kümeleri tanımlaması için hücre dışı ve/veya hücre içi işaretleri eşzamanlı tespiti gereklidir Sınıf II. En yaygın olarak kullanılabilir mikroskoplar floresein isothiocyanate (FITC) ve phycoerythrin (PE), gibi en az iki renk kanallarına sınırlıdır eğer tarafından bağışıklık hücreleri belirli alt kümeleri karakterizasyonu kısıtlayıcı ve eksik, gerektiren olabilir birden çok slayt, gerek hangi lekeli ve paralel olarak analiz ilgi, aynı alanından türetilmiş. Bu zaman alan yönü bu nedenle does değil gerekli ödünç vermek kendisi büyük örnek kümeleri çözümleme için. Ayrıca, ilgi işaretlerinin çoğu hücre dışı gibi algılama ya parafin veya cryoconserved katıştırılmış, doku membran bütünlüğü bozulma ve epitopları maskeleme, hem de kaybı nedeniyle sorunlu olabilir antijenlere aseton ve metanol9gibi çözücülerin kullanımından ilgi.
Buna ek olarak, Akış Sitometresi, optik ölçen ve süspansiyon tek hücre özelliklerini Floresan ışık, bir demeti geçerken sağlar hücre popülasyonlarının çözümlenmesi için daha pratik ve kapsamlı bir araç. Doku, dijital bir görüntüsünü üreten yerine Akış Sitometresi sağlar bir hücrenin göreli boyutu ve ileri dağılım (FSC), parçalı yapı/iç karmaşıklık anılacaktır yansıtıcı dizin içeren parametreleri ayarlama, otomatik bir miktar veya yan-dağılım (SSC) ve göreceli floresan yoğunluğu, hücre konjuge bir antikor gibi uygun bir fluorophore ile etiketli sağlayan. Tipik Akış Sitometresi iki, hava soğutmalı lazerler oluşur; bir argon lazer 488, mavi ışık üretir nm ve helyum-neon lazer üreten ışıkta 633 nm. Bu kombinasyon algılama ve ölçüm, için aynı anda, en az beş hedef yüzeyi veya hücre içi bölme içinde sağlar. Daha gelişmiş akış cytometers seçilen fluorochromes, en yüksek emisyon dalga boylarında önemli ölçüde örtüşmeyen sağlayan sekiz farklı fluorochromes tespiti için bir kez, izin birden çok lazerler bileşiminden oluşabilir.
Akış Sitometresi tarafından analiz etmek için doku ilgi ilk enzimatik, bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için genellikle collagenase ile sindirilir olun gerekir. Fare siyatik sinir analiz daha önce her fareden alınan doku az miktarda nedeniyle zor olmuştur. Buna ek olarak, miyelin aksonlar çevresinde yüksek yağ içeriği hücre kurtarma engellemektedir ve enkaz büyük miktarlarda üretir. Siyatik sinir hazırlık ve sindirim için burada açıklanan yöntemi Barrette vd Schwann hücresi yalıtım kuralından adapte oldu 7ve sinirler için Akış Sitometresi Analizi, bireysel farelerin yeterli hücrelerden fareler arasında varyasyon azaltmak için izole amaçlamaktadır. Tek Kişilik hücrelerde ham doku Özet tanımlanması için DAPI kullanarak sık hücre kaybına neden axon enkaz kaldırmak gerek kaçınmanızı sağlar. Çamaşır deterjan zengini arabellek AIDS hücrelerinin sürümdeki ile birkaç kez böylece verim artırma yağlı enkaz içinde sıkışmış. Bu protokole göre tek bir fareden her iki tam uzunlukta siyatik sinir sindirim ≥30, 000 tek çekirdekli olayları oluşturur ve en az 3 kez bu rakam DRG alınmadı. CD45 oranı+ lökosit yapıldı Toplam hücre içeriğini siyatik sinir Özet ve yaklaşık yaklaşık % 5’i DRG Özet % 5-10. CD45 çoğunluğu+ siyatik sinir hücrelerinde ifade makrofaj işaretleri, CD68 ve CD206.
Protocol
Representative Results
Discussion
Siyatik sinir lipidler, kolesterol, miyelin aksonlar çevresinde içeriği nedeniyle gibi büyük bir oranda içerir. Bu yana sıcaklık ile lipidler özelliklerini değiştirmek, farklı sonuçlar farklı sıcaklıklarda alınabilir. Hücre koruma sağlamak için tüm merdiven içinde bu protokolü sindirim sonra buz üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tutarlılık sonuçları tekrarlanabilirlik iyiliği için tavsiye edilir iken, 3,6 ve 3,7 oda sıcaklığında adımları uygulayarak verim artışı mümkün olabilir. A…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; tarafından desteklenen SFB1118). Yazarlar Axel Erhardt diseksiyon çoğunu gerçekleştirmek ve yardımsever bu bilgi verici ve Dr Volker Eckstein Akış Sitometresi teknik açıdan yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| C57BL/6 Mouse | Charles River | C57BL/6NCrl | |
| DMEM (+1g/L glucose, Glutamine, Pyruvate) | Thermo | 31885023 | The source of this material is not important |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corp., US | LS004188 | |
| Deoxyribonuclease (DNase) I from bovine pancreas I | Sigma-Aldrich | DN25-1g | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Foetal Calf Serum (FCS), heat inactivated | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Antibody against CD11b-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 101228 | Clone M1/70 |
| Antibody against MHC class II, biotinylated | Biolegend | 107603 | Clone M5/114.15.2 |
| Antibody against CD45-A647 | Biolegend | 107603 | Clone 30-F11 |
| Antibody against CD68-APC | Biolegend | 137007 | Clone FA/11 |
| Antibody against CD206-PE | Biolegend | 141706 | Clone C068C2 |
| Antibody against F4/80-PE/Cy7 | Biolegend | 123113 | Clone BM8 |
| Streptavidin-PE/Cy7 | Biolegend | 405206 | Used to detect MHCII-biotin with CD45-A647 and CDllb-PerCP/Cy5.5 |
| Streptavidin-PerCP | Biolegend | 405213 | Used to detect MHCII-biotin with CD68-APC and F4/80-PE/Cy7 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dilute in PBS to a 50x and store at 4 °C in the dark |
| Cell dissociation sieve – tissue grinder kit | Sigma-Aldrich | CD1 | |
| V-Shaped, 96-well plates | Greiner/Sigma | M8185 | |
| 5ml polystryene round-bottom tube, 12x75mm | BD Biosciences | 352008 | |
| 60x15mm petri dish | Greiner/Sigma | Z643084 | |
| BD LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences |
Referencias
- DeFrancesco-Lisowitz, A., Lindborg, J. A., Niemi, J. P., Zigmond, R. E. The neuroimmunology of degeneration and regeneration in the peripheral nervous system. Neurociencias. 302, 174-203 (2014).
- Sica, A., Erreni, M., Allavena, P., Porta, C. Macrophage polarization in pathology. Cell. Mol. Life Sci. 72, 4111-4126 (2015).
- Vergadi, E., Ieronymaki, E., Lyroni, K., Vaporidi, K., Tsatsanis, C. Akt Signaling Pathway in Macrophage Activation and M1/M2 Polarization. J. Immunol. 198, 1006-1014 (2017).
- Perrin, F. E., Lacroix, S., Avilés-Trieueros, M., David, S. Involvement of monocyte chemoattractant protein-1, macrophage inflammatory protein-1alpha and interleukin-1beta in Wallerian degeneration. Brain. 128, 854-866 (2005).
- Niemi, J. P., et al. A Critical Role for Macrophages Near Axotomized Neuronal Cell Bodies in Stimulating Nerve Regeneration. J Neurosci. 33, 16236-16248 (2013).
- Mokarram, N., Merchant, A., Mukhatyar, V., Patel, G., Bellamkonda, R. V. Effect of modulating macrophage phenotype on peripheral nerve repair. Biomaterials. 33, 8793-8801 (2012).
- Martini, R., Willison, H. Neuroinflammation in the peripheral nerve: Cause, modulator, or bystander in peripheral neuropathies?. Glia. 64, 475-486 (2016).
- Carriel, V., Garzón, I., Alaminos, M., Cornelissen, M. Histological assessment in peripheral nerve tissue engineering. Neural Regen. Res. 9, 1657-1660 (2014).
- Leong, T. Y. -. M., Leong, A. S. -. Y. How does antigen retrieval work?. Adv. Anat. Pathol. 14, 129-131 (2007).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J. Neurosci. 28, 9363-9376 (2008).
- Liu, L., Yin, Y., Li, F., Malhotra, C., Cheng, J. Flow cytometry analysis of inflammatory cells isolated from the sciatic nerve and DRG after chronic constriction injury in mice. J. Neurosci. Methods. 284, 47-56 (2017).
- Pannell, M., et al. Adoptive transfer of M2 macrophages reduces neuropathic pain via opioid peptides. J. Neuroinflammation. 13, 262 (2016).
- Hidmark, A. S., Nawroth, P. P., Fleming, T. STZ causes depletion of immune cells in sciatic nerve and dorsal root ganglion in experimental diabetes. J. Neuroimmunol. 306, 76-82 (2017).
